熒光假單胞菌GcM5-1A鞭毛蛋白對(duì)黑松的作用機(jī)理及蛋白酶抑制劑防治松褐天牛的應(yīng)用研究.pdf

1、采用細(xì)胞免疫熒光分析、細(xì)胞染色觀察、電導(dǎo)率測定以及基因組DNA電泳分析技術(shù)，對(duì)松材線蟲攜帶的熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens GcM5-1A）分泌的鞭毛蛋白對(duì)黑松愈傷組織細(xì)胞的作用及其致死方式進(jìn)行研究。結(jié)果表明，鞭毛蛋白與黑松（Pinus thunbergii）細(xì)胞之間存在直接的相互作用；鞭毛蛋白處理的細(xì)胞，細(xì)胞膜皺縮變形、細(xì)胞質(zhì)濃縮、細(xì)胞核解體，形成若干小核，細(xì)胞質(zhì)中的RNA降解；處理細(xì)胞的著色力增強(qiáng)，細(xì)胞

2、培養(yǎng)液的電導(dǎo)率增加，說明鞭毛蛋白可增加處理細(xì)胞的細(xì)胞膜透性；基因組DNA的電泳分析證實(shí)，處理細(xì)胞的DNA發(fā)生了斷裂，但無明顯的梯子形成，推測鞭毛蛋白對(duì)黑松細(xì)胞的致死方式為非典型的細(xì)胞凋亡。
　　 為進(jìn)一步驗(yàn)證鞭毛蛋白的毒性，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了組成分泌表達(dá)載體pUC18ompA，將熒光假單胞菌Pf-5鞭毛蛋白的編碼基因fliC克隆到pUC18ompA構(gòu)建pUC18ompA-fliC，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)構(gòu)建了工程

3、菌。工程菌與無菌松材線蟲混合接種黑松無菌苗，研究其對(duì)無菌苗的致病能力。接種試驗(yàn)結(jié)果表明，工程菌與無菌松材線蟲混合接種同樣可以引起黑松無菌苗的萎蔫。進(jìn)一步驗(yàn)證了體內(nèi)熒光假單胞菌鞭毛蛋白在松萎蔫病致病過程中的作用。
　　 本研究還對(duì)松萎蔫病的防治做了初步探討。從沙蠶(Perinereis aibuhitensisGrube)的cDNA文庫中篩選并鑒定了一半胱氨酸蛋白酶抑制劑(CPI)基因。氨基酸序列分析結(jié)果顯示，該基因編碼蛋白與斑馬

4、魚(Danio rerio)Zgc:153129，水蛭cystatin B以及人ChainA，stefin B四聚體的同源性分別為51％，48％和48％。CPI基因克隆到胞內(nèi)表達(dá)載體pET-15b，并在大腸桿菌中表達(dá)。經(jīng)Ni+親和層析和DEAE-Sepharose FF離子交換層析純化重組CPI(PA-CPI)。聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析推測，PA-CPI相對(duì)分子量為16KDa。活性分析顯示，重組蛋白能夠抑制木瓜蛋白酶的