胞外蛋白酶抑制劑基因expi對大鼠肝再生的作用研究.pdf

1、胞外蛋白酶抑制劑基因expi編碼的蛋白與蛋白酶活性的有關(guān)，并參與細(xì)胞的遷移和凋亡活動。本實驗室的大鼠再生肝RatGenome230.20芯片檢測結(jié)果表明，expi在大鼠2/3肝切除后6h起始表達(dá)，6-72h持續(xù)表達(dá)上調(diào)，并在30h達(dá)到表達(dá)高峰，是對照的33倍。但目前還沒有人研究其在肝在生中的功能，而作為重要生命活動的肝再生也涉及蛋白質(zhì)降解，細(xì)胞遷移和凋亡等生理生化活動，了解該基因在肝再生中的功能，有助于揭示肝再生分子機(jī)制。為此，本文挑選

2、出基因expi，以Higgins等那建立的大鼠2/3肝切除模型做為研究對象，利用大鼠尾靜脈液壓轉(zhuǎn)基因技術(shù)，通過基因添加和RNA干涉的方法，研究expi在大鼠肝再生中的作用。
　　 根據(jù)expi的基因序列設(shè)計引物并克隆該基因，同時設(shè)計其兩條RNA干涉片段，然后進(jìn)行載體的構(gòu)建。將上述測序正確的基因及其干涉片段連接到不同的載體上，構(gòu)建三套載體：一套是表達(dá)載體pEGFP-N1-expi，用于基因添加實驗；另一套是干涉載體，包括pGene

3、si1-1.0-E6和pGenesi1-1.0-E147,用于干涉目的的基因的實驗；最后一套是檢驗載體，包括pGenesi1-1.0-E6-expi,pGenesi1-1.0-E147-expi和pGenesi1-1.0-HK-expi,用于檢驗設(shè)計的兩條干涉片段是否對靶基因產(chǎn)生干涉作用。
　　 將構(gòu)建的三條檢驗載體分別進(jìn)行尾靜脈液壓轉(zhuǎn)基因操作，通過觀察轉(zhuǎn)干涉檢驗載體和綠恍熒光蛋白陽性細(xì)胞率（轉(zhuǎn)染率）相較對照檢驗載體是否有明顯減

4、少，來判斷設(shè)計的干涉片段是否對靶位點具有干涉作用。將表達(dá)載體和干涉載體分別進(jìn)行液壓轉(zhuǎn)基因操作，分別在轉(zhuǎn)基因后6、12、24、36、48、60、72和84h取材觀察其綠色熒光蛋白陽性細(xì)胞率、通過統(tǒng)計分析得出各載體在大鼠肝臟組織中表達(dá)高峰的時間點，結(jié)合expi芯片檢測結(jié)果，得出2/3肝切除后的最佳轉(zhuǎn)基因時間。根據(jù)以上結(jié)果，利用2/3肝切除手術(shù)制備的大鼠肝再生模型和液壓轉(zhuǎn)基因技術(shù)展開expi對大鼠肝再生過程影響的研究。將制備好的轉(zhuǎn)基因后的再生

5、肝材料分別于2/3肝切除后72、120和168h取出，用熒光顯微技術(shù)、統(tǒng)計學(xué)方法的常規(guī)組織學(xué)技術(shù)對死亡率、表達(dá)動力學(xué)、肝指數(shù)和組織形態(tài)結(jié)構(gòu)等方面結(jié)果進(jìn)行觀察與分析。
　　 測序和電泳檢測結(jié)果顯示：基因expi克隆成功，其表達(dá)載體、干涉載體和檢驗載體構(gòu)建成功。熒光觀察結(jié)果表明，轉(zhuǎn)檢驗載體pGenesil-1.0-E6-expi和pGenesi1-1.0-E147-expi的綠色熒光蛋白陽性細(xì)胞率明顯低于其對照載體pGenesi1-

6、1.0-HK-expi，這說明設(shè)計的兩干涉片段對靶位點均具有干涉作用。轉(zhuǎn)表達(dá)載體pEGFP-N1-expi和干涉載體pGenesi1-1.0-E6與pGenesi1-1.0-E147后，統(tǒng)計分析陽性細(xì)胞率得出各載體在大鼠肝臟組織中表達(dá)高峰的時間點是轉(zhuǎn)基因后12h，結(jié)合expi芯片檢測結(jié)果，得出最佳轉(zhuǎn)基因時間點是2/3肝切除后18h。
　　 肝指數(shù)檢測結(jié)果表明，在進(jìn)行expi基因添加時，肝指數(shù)高于對照；進(jìn)行expi基因干涉時，肝指