TGEV感染的ST細(xì)胞mRNA和lncRNA表達(dá)譜變化及其功能預(yù)測(cè).pdf

1、豬腹瀉病是制約我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展最為突出的一類疾病，其中由豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）所致的豬腹瀉病，即豬傳染性胃腸炎（Transmissible gastroenteritis，TGE），流行范圍廣、危害大。目前TGE防治成效仍不理想，主要原因是對(duì)TGEV感染致病機(jī)制和宿主應(yīng)答反應(yīng)還缺乏足夠的認(rèn)識(shí)。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lnc

2、RNA）是新發(fā)現(xiàn)的一類具有重要生物學(xué)功能的分子，與細(xì)胞分化、個(gè)體發(fā)育和疾病發(fā)生關(guān)系密切，是生命科學(xué)研究的前沿?zé)狳c(diǎn)。然而，迄今關(guān)于lncRNA是否在TGEV感染致病過程中發(fā)揮作用尚未見報(bào)道，對(duì)TGEV感染后宿主功能基因的應(yīng)答反應(yīng)及其機(jī)制也知之甚少。因此，本研究以豬睪丸（ST）細(xì)胞為試驗(yàn)材料，利用高通量測(cè)序技術(shù)揭示TGEV感染誘導(dǎo)的ST細(xì)胞mRNA/LncRNA表達(dá)譜變化，挖掘差異表達(dá)mRNA/lncRNA，再通過生物信息學(xué)手段分析預(yù)測(cè)差異

3、表達(dá)mRNA/lncRNA在病毒感染過程中的功能，試圖從mRNA和lncRNA兩個(gè)角度探索ST細(xì)胞對(duì)TGEV的應(yīng)答反應(yīng)機(jī)制。本研究包括以下三方面：
　?。?）TGEV感染ST細(xì)胞早期和后期轉(zhuǎn)錄組文庫的建立和高通量測(cè)序：將ST細(xì)胞分別用TGEV感染處理0h、6h和48h（每組3次生物學(xué)重復(fù)），分別代表未感染、感染早期和感染后期3個(gè)階段，依次標(biāo)記為MOCK、ST-TGEV-6h和ST-TGEV-48h。每組混合提取總RNA，構(gòu)建RNA

4、文庫；利用RNA-seq技術(shù)對(duì)3組文庫進(jìn)行高通量測(cè)序。結(jié)果每組樣品均獲得了千萬級(jí)數(shù)量的clean reads，其中50％以上的reads可以比對(duì)上參考基因組，這說明測(cè)序的通量確實(shí)高，大量的測(cè)序數(shù)據(jù)為后續(xù)的生物信息學(xué)分析提供了良好的基礎(chǔ)。
　?。?）TGEV感染早期和后期ST細(xì)胞中差異表達(dá)mRNA的篩選分析：篩選組間差異表達(dá)的mRNA并進(jìn)行KEGG和GO分析，分析差異mRNA在TGEV感染早期和后期參與的生物進(jìn)程和信號(hào)通路；隨機(jī)選取

5、16個(gè)差異mRNA利用熒光定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證，檢驗(yàn)測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性。結(jié)果顯示在TGEV感染早期，篩選得到436個(gè)差異表達(dá)的mRNA（ST-TGEV-6h比較MOCK），其中388個(gè)上調(diào)，48個(gè)下調(diào)；在TGEV感染后期，篩選到308個(gè)差異表達(dá)的mRNA（ST-TGEV-48h比較ST-TGEV-6h），其中182個(gè)上調(diào)，126個(gè)下調(diào)。差異mRNA的GO分析結(jié)果顯示，差異mRNA廣泛參與了細(xì)胞免疫、疾病、能量代謝、核酸代謝和組織發(fā)育等過程。

6、本研究著重關(guān)注TGEV感染與細(xì)胞免疫的關(guān)系，通過KEGG分析發(fā)現(xiàn)：在TGEV感染早期，ST細(xì)胞激活了TNF，溶酶體和吞噬體等信號(hào)通路參與免疫應(yīng)答；在感染后期，差異mRNA在 Toll樣受體信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路和細(xì)胞凋亡等多個(gè)通路中富集。結(jié)合測(cè)序結(jié)果和熒光定量PCR對(duì)Toll樣受體信號(hào)通路中的基因表達(dá)量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)TGEV感染激活了Toll樣受體信號(hào)通路中的TLR3信號(hào)通路，刺激了β干擾素（Interferon-β，IFN-β

7、）的表達(dá)。
　?。?）TGEV感染早期和后期ST細(xì)胞中差異表達(dá)lncRNA的篩選分析：篩選組間差異表達(dá)的lncRNA并隨機(jī)挑選25個(gè)差異lncRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，結(jié)合mRNA測(cè)序及生物信息學(xué)分析結(jié)果，解析差異lncRNA在TGEV感染過程中的作用。隨機(jī)選取8個(gè)差異lncRNA，利用熒光定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證，檢驗(yàn)測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性。結(jié)果顯示，在TGEV感染早期有23個(gè)表達(dá)差異的已知lncRNA，其中上調(diào)15個(gè)，下調(diào)8個(gè)；病毒感染后期有

8、67個(gè)差異已知lncRNA，其中上調(diào)7個(gè)，下調(diào)60個(gè)。LncRNA的靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，7差異個(gè)lncRNA具有 trans作用的靶基因，其中l(wèi)ncRNA LOC100524077預(yù)測(cè)的下游靶基因中SPP1和PKD2在TGEV感染過程中表達(dá)水平差異顯著。此外，對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)共有8142個(gè)新lncRNA表達(dá)，其中有4個(gè)新lncRNA在TGEV感染早期差異表達(dá)，4個(gè)新lncRNA在TGEV感染后期差異表達(dá)。熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)

9、果與高通量測(cè)序結(jié)果相符，說明lncRNA篩選結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
　　總之，通過高通量測(cè)序技術(shù)，本研究揭示了TGEV感染誘導(dǎo)的ST細(xì)胞mRNA和lncRNA表達(dá)譜變化；發(fā)現(xiàn)TGEV感染誘導(dǎo)的ST細(xì)胞差異表達(dá)mRNA參與了數(shù)千種生物進(jìn)程，且TGEV感染早期可激活TNF、溶酶體和吞噬體等免疫相關(guān)信號(hào)通路，后期還激活了TLR3/IFN-β信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)IFN-β表達(dá)以發(fā)揮抗病毒免疫應(yīng)答作用，對(duì)TGE防治具有重要參考價(jià)值；發(fā)現(xiàn)lncRNA