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文檔簡介
1、丙型肝炎病毒(HCV)與慢性肝炎,肝硬化和原發(fā)性肝癌(HCC)的形成密切相關(guān)。核心蛋白作為構(gòu)成HCV衣殼蛋白的結(jié)構(gòu)蛋白,是HCV最重要的成分之一,其參與了包括HCV的免疫逃逸,因HCV感染導(dǎo)致的肝纖維化和HCC等肝臟疾病和抵抗藥物治療等過程。HCC作為一種高致死率的惡性腫瘤,近年來發(fā)病率持續(xù)升高,而細(xì)胞周期異常,凋亡抵抗和癌基因及相關(guān)通路的激活是其發(fā)生的主要分子機(jī)制。非編碼RNA(ncRNA)是不編碼蛋白質(zhì)的RNA的總稱,其中的長非編碼
2、RNA(lncRNA)是近年來生物醫(yī)學(xué)研究的熱點內(nèi)容,其參與了生物生長發(fā)育和包括HCC在內(nèi)的諸多疾病發(fā)病過程。新近發(fā)現(xiàn)的環(huán)狀RNA(circRNA)由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和具有的如吸附miRNA以及參與癌癥發(fā)生發(fā)展的相關(guān)信號通路等生物學(xué)功能,得到了越來越多的關(guān)注。已報道發(fā)現(xiàn),有l(wèi)ncRNA參與到了乙型肝炎病毒(HBV)導(dǎo)致的肝癌中,例如HBV的HBx蛋白能下調(diào)lncRNA-Dreh從而促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。但HCV或者其核心蛋白通過調(diào)控lnc
3、RNA分子導(dǎo)致HCC的研究卻極為鮮見,考慮到HCV與HBV的相似性,可以推測HCV或者HCV核心蛋白導(dǎo)致HCC的過程中可能有l(wèi)ncRNA分子的參與。此外,circRNA在疾病診斷和治療中的具有巨大的研究與應(yīng)用前景,基于以上研究背景,本研究開展了如下工作:
目的:
以HCV1b基因型核心蛋白作為研究對象,探討HCV核心蛋白對人Huh7肝癌細(xì)胞mRNA、lncRNA和circRNA表達(dá)的影響的研究,并初步分析HCV核心蛋
4、白導(dǎo)致的HCC致癌的相關(guān)分子機(jī)制。
方法:
構(gòu)建重組表達(dá)載體PEGFP-Core(HCV核心蛋白為基因型為1b),將該重組表達(dá)載體和空載體PEGFP-C1分別轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞,經(jīng)G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株并用RT-PCR檢測核心蛋白的表達(dá)。在抽提RNA后通過lncRNA芯片和環(huán)狀RNA(circRNA)芯片分析得到HCV核心蛋白表達(dá)對Huh7細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響情況。隨后找出表達(dá)差異>2.0的lncRNA分子和cir
5、cRNA分子,通過生物信息學(xué)分析,找出這些變化的分子與相關(guān)生理病理改變的關(guān)聯(lián)性;并同時結(jié)合閱讀文獻(xiàn)和利用相關(guān)分子靶位點預(yù)測平臺,挑選相關(guān)基因并給出預(yù)測的可能致癌通路,對其中的相關(guān)基因的差異表達(dá)情況進(jìn)qPCR驗證,最后通過構(gòu)建相關(guān)相關(guān)基因的重組表達(dá)載體并瞬時轉(zhuǎn)染Huh7-core細(xì)胞克隆,從而進(jìn)一步對相關(guān)的信號通路進(jìn)行探究。
結(jié)果:
LncRNA芯片包含兩個部分,其中l(wèi)ncRNA檢測部分含有30586個基因位點,mRN
6、A檢測部分含有26109個基因位點。結(jié)果顯示,與對照組相比,有4851個lncRNA表達(dá)上調(diào)和3569個lncRNA表達(dá)下調(diào)超過2倍;4785個mRNA表達(dá)上調(diào)和3192個mRNA表達(dá)下調(diào)超過對照組基因表達(dá)2倍。CircRNA芯片(含有5396個位點),分別發(fā)現(xiàn)了823個基因表達(dá)上調(diào)和419個基因表達(dá)下調(diào)超過對照組基因表達(dá)2倍。通過聚類分析和GO分析發(fā)現(xiàn),這些分子參與了包擴(kuò)細(xì)胞內(nèi)大分子代謝,核酸代謝等代謝過程以及DNA損傷反應(yīng),鈣離子通
7、道調(diào)控等生化反應(yīng)。通過KEGG Pathway分析,這些分子與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,凋亡,鈣離子信號途徑,Wnt信號途徑,HBV,HCV感染等信號通路存在關(guān)聯(lián)。此外經(jīng)過qPCR驗證了預(yù)測的信號通路中高表達(dá)或低表達(dá)的10個相關(guān)分子。最后通過構(gòu)建信號通路中的相關(guān)分子(miR122,miR192,miR204)的基因表達(dá)載體,探討了其表達(dá)對通路中其它分子可能的調(diào)控作用。
結(jié)論:
miR204-HPCAL1,HOTTIP-GLS,和C
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