葛根芩連湯含藥血清及其主要代謝物對人肝癌huh7細胞株P38MAPK信號通路的作用及差異蛋白表達的研究.pdf

1、肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）屬于消化系統(tǒng)惡性腫瘤，肝癌患者的死亡率在全球排第三位，每年可發(fā)生高達700000例的病例。發(fā)病原因大多是由病毒性肝炎、酒精或肝毒物質引起。對于肝癌的治療，臨床上一般以手術切除和化療作為主要手段，但是目前使用的化療藥物不良反應大、選擇性差、易引起耐藥性，因此，選取中藥對肝癌進行治療的優(yōu)勢日益突出，目前，已有大量關于中藥治療肝癌的研究，并且許多中藥活性成分已經被證實具有治療肝癌

2、的藥理活性。
　　葛根芩連湯來源于漢·張仲景《傷寒論》，處方由葛根、甘草、黃芩和黃連四味藥組成，是中醫(yī)藥配伍精華理論的名方之一。中藥復方成分多，作用靶點多，經吸收入血生物轉化后，產生療效的可能是存在于復方中的藥物原型，也可能是復方代謝產物或新物質?；谥兴帍头降奶攸c，對中藥復方藥效的研究不應該只局限于研究復方整體的作用，或只研究復方中單一成分及含量較高的成分，應當充分考慮中藥復方的藥代動力學特點，選取中藥復方含藥血清與主要代謝入血

3、成分作為對象進行研究，并結合體內外實驗及血清藥理等方法，從復方含藥血清與主要代謝物入手，可以更充分有效地闡明中藥復方的作用機理。目前對于葛根芩連湯的大多數研究都只限于整方及主要單體的質量控制及藥效作用研究，而主要單體成分不一定是最好的藥效活性成分，基于對葛根芩連湯整方及代謝成分藥效作用的相關研究較少，本研究將以此對葛根芩連湯進行更深入、更詳盡地開發(fā)研究，此外，本研究方法也為復方的研究及新化合物作為先導藥物提供了新的思路。
　　本研

4、究利用MTT比色法、實時熒光定量PCR法和western blot法研究葛根芩連湯含藥血清及其主要代謝物對huh7肝癌細胞株P38MAPK信號通路的影響和相互關系。首先通過MTT法確定含藥血清組及各代謝物組給藥濃度，再用熒光定量PCR法檢測huh7細胞P38MAPK信號通路中各基因mRNA轉錄水平；Western blot法檢測huh7細胞P38MAPK信號通路中各蛋白的表達情況。蛋白質凝膠電泳結果表示，葛根芩連湯含藥血清組對P38、J

5、NK的表達有上調作用，對ERK的表達有下調作用；葛根素對ERK的表達有下調作用，對JNK的表達有上調作用；大豆苷對P38、JNK的表達有上調作用；大豆苷苷元對P38的表達有上調作用(P<0.05)。通過研究結果可知，葛根芩連湯與葛根素、大豆苷、大豆苷苷元對P38MAPK信號通路的影響各不相同，但三者藥效的協(xié)同作用是與葛根芩連湯一致的，因此，選取葛根芩連湯及其主要代謝物進行平行研究，可以更好地揭示葛根芩連湯發(fā)揮藥效作用的機制，更有利于對葛

6、根芩連湯及其藥效物質之間的關系進行深入探索和開發(fā)。
　　本研究將血清藥理學與蛋白質組學中2-DE技術相互結合，通過分析大鼠對照血清和大鼠給藥血清作用后的兩組huh7細胞雙向電泳圖譜，尋找兩組中的差異蛋白，從而能夠準確、有效地展示與葛根芩連湯作用相關的蛋白。研究結果表明，大鼠對照血清組細胞與大鼠給藥血清組細胞，兩組差異表達的蛋白質點數為60個，利用質譜成功鑒定出5個差異蛋白，分別為：纖連蛋白（Fibronectin）、Deoxyur

7、idine5’-triphosphate nucleotidohydrolase、銅-鋅超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase[Cu-Zn]）、腺苷酸環(huán)化酶1（Adenylate cyclase type1）、GDP解離抑制因子(Rho GDP dissociation inhibitor，GDI)。其中，纖連蛋白、Deoxyuridine5’-triphosphate nucleotidohydrolase、銅-鋅超