人表皮干細胞lncRNA與mRNA差異表達相關(guān)性及其作為ceRNA的作用分析.pdf

1、目的：觀察人表皮干細胞和已分化的角質(zhì)形成細胞中l(wèi)ncRNA和mRNA的差異表達及其相關(guān)性，初步探索lncRNA作為競爭性內(nèi)源性RNA（ceRNA）參與調(diào)控表皮干細胞的自我更新及分化，獲得更多有關(guān)表皮干細胞體外復(fù)制、擴增和分化調(diào)控的新信息，為組織工程構(gòu)建皮膚提供更理想的種子細胞來源，為未來創(chuàng)面愈合的基因治療提供線索。
　　方法：
　　（1）取泌尿外科行包皮環(huán)切術(shù)患者的正常包皮組織，采用酶消化法和Ⅳ型膠原快速貼壁法獲得A組人表皮

2、干細胞、B組角質(zhì)形成細胞。倒置顯微鏡下觀察兩組細胞的生長狀況，免疫細胞化學(xué)染色法行β1整合素、CK1、CK10、CK19單抗檢測鑒定。用Trizol一步法分別提取2組細胞總RNA并質(zhì)檢，純化后進行熒光標(biāo)記、芯片雜交，然后掃描得到雜交圖片，利用軟件提取數(shù)據(jù)并行差異性分析，同時應(yīng)用RT-PCR法驗證芯片結(jié)果的可靠性。對差異表達的蛋白編碼基因行GO分析和Pathway分析。
　?。?）結(jié)合以往文獻報道，通過UCSC在線軟件對本試驗中表皮

3、干細胞中差異表達LncRNA進行整合，歸納總結(jié)出差異表達的反義鏈型lncRNA、正義鏈型lncRNA、增強型lncRNA及基因間lncRNA。接著利用BLAST在線軟件檢測差異表達的外顯子正義鏈型lncRNA和其鄰近差異表達蛋白編碼基因的堿基相似性，以尋找可能的競爭性內(nèi)源性lncRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異表達NR_073046和NR_045013分別與鄰近蛋白編碼基因序列高度相似，故借助靶基因預(yù)測軟件Targetscan及miRanda分別對

4、其可能結(jié)合的靶miRNA進行預(yù)測，以進一步預(yù)測這兩個lncRNA的競爭性結(jié)合機制。除此以外，計算4個異常表達的lncRNA和mRNA的皮爾森系數(shù)，以相關(guān)系數(shù)的絕對值大于0.99且P值小于0.001為閾值，尋找共表達lncRNA-mRNA對，并構(gòu)建了lncRNA-mRNA共表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖，并對差異lncRNA靶基因進行了GO分析及Pathway分析，以更好地驗證lncRNA與mRNA的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　?。?）快速黏附于

5、Ⅳ型膠原的A組細胞培養(yǎng)3 d能形成明顯克隆，免疫細胞化學(xué)染色顯示β1整合素及CK19呈陽性表達，符合表皮干細胞特征；不能快速黏附于Ⅳ型膠原的B組細胞培養(yǎng)3 d無明顯克隆形成，CK1及CK10呈陽性表達，符合角質(zhì)形成細胞的特征。提取兩組細胞總RNA質(zhì)檢合格后篩選出3720條lncRNA和4069條mRNA有差異性表達，其中2292條lncRNA明顯上調(diào)，1428條lncRNA明顯下調(diào)，1248條mRNA明顯上調(diào)，2821條mRNA明顯下調(diào)

6、，RT-PCR驗證結(jié)果與芯片檢測結(jié)果具有較好的一致性，且GO分析條目涵蓋增殖、生長、凋亡等條目。
　?。?）對差異表達的lncRNA行亞類分析，發(fā)現(xiàn)其中有165條反義鏈型lncRNA，759條外顯子正義鏈型lncRNA，293條增強型lncRNA以及768條基因間型lncRNA。緊接著對外顯子正義鏈型lncRNA行堿基相似性分析發(fā)現(xiàn)15條lncRNA與鄰近蛋白編碼基因相似基序列達到90％以上，其中差異表達NR_073046和 NR

7、_045013分別與鄰近蛋白編碼基因DEDD2和LMO3的相似序列達到100%。進一步的靶miRNA預(yù)測，發(fā)現(xiàn)NR_073046可與DEDD2競爭性互補配對結(jié)合432條miRNA，其中有10條miRNA為高度互補配對且相對保守,比如miR-204-5P/211-5p, NR_045013可與LMO3競爭性互補配對結(jié)合960條miRNA，其中有62條miRNA是高度互補配對且相對保守，比如miR-200a-3p/141-3p，miR-48

8、9-3p，miR-199-5p，而且lncRNA-mRNA共表達分析表明NR_073046和NR_045013分別與DEDD2和LMO3的表達存在相關(guān)性。
　　結(jié)論：
　?。?）體外培養(yǎng)的人表皮干細胞與角質(zhì)形成細胞lncRNA與mRNA表達譜存在明顯差異，這可能與兩者不同的增殖分化能力等生物學(xué)特性有關(guān)。
　?。?）差異表達的NR_073046和NR_045013可能通過競爭性內(nèi)源性機制結(jié)合miRNA，分別調(diào)控相應(yīng)蛋白編