膀胱移行細胞癌中c-FLIP mRNA表達及臨床相關性.pdf

1、膀胱癌在中國是最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一。其組織病理類型以移行細胞癌(transitional cell carcinoma，TCC)為主，約占90％以上。對膀胱腫瘤的病因研究很多，但病因仍不清楚。目前學者們普遍認為膀胱腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個復雜的多因素、多步驟、多變化的過程，是細胞凋亡增殖失衡的結(jié)果。 細胞型Fas相關死亡區(qū)域蛋白樣白介素-1β轉(zhuǎn)換酶抑制蛋白(cellular FADD-1ike interleukin-1β

2、-converting enzyme inhibitory protein c-FLIP)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類含有死亡效應結(jié)構(gòu)域(death effect domains，DED)的凋亡抑制蛋白，已證實c-FLIP與炎癥、腫瘤、自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展有關。因此對c-FLIP的進一步研究將有助于深化對這些疾病的認識，并為臨床治療這些疾病提供新的方法和思路。為進一步明確膀胱移行細胞癌發(fā)生發(fā)展過程中c-FLIP所起到的作用，并且進一步探討其對

3、膀胱腫瘤預后的影響，我們采用免疫組化及半定量RT-PCR方法探討c-FLIP mRNA及其蛋白在膀胱移行細胞癌中的表達情況。探討c-FLIP mRNA的表達與膀胱移行細胞癌的臨床分期、病理組織分級及預后之間的關系，現(xiàn)將結(jié)果報導如下。 材料與方法： 一、臨床資料 (一)一般資料 收集2002年4月至2005年10月，我科手術治療膀胱移行細胞癌患者100例。從中隨機選出30例，男23例，女7例，年齡在20歲-

4、80歲。按臨床分期標準：T0期6例，T1期8例，T2期9例，T3期7例。按病理分級標準：Ⅰ級4例、Ⅰ-Ⅱ級12例、Ⅱ級5例、Ⅱ-Ⅲ級5例、Ⅲ級4例，同時采集10例正常膀胱移行上皮組織，年齡46歲-61歲。取材后，置入-80℃低溫冰箱保存?zhèn)錂z。 (二)實驗試劑和儀器 免疫組化試劑盒購于北京博奧森生物技術公司、c-FLIP兔抗人抗體(一抗)購于北京博奧森生物技術有限公司。其中試劑盒中包括：3％H2O2去離子水、封閉用正常山羊

5、血清工作液、生物素化二抗工作液，為生物素標記的山羊抗兔LgG、辣根酶標記鏈霉卵白素工作液。R-PCR試劑盒購于Takara Shuzo Co．Ltd．；c-FLIP-F，c-FL,IP-R及β-actin引物購于Takara公司；TRIZOL試劑購于GIBCOBRL公司；超凈工作臺、石蠟切片機(上海)；聚乙烯探子(北京)；TG328B光電分析天平(上海)；低溫冰箱及超低溫冰箱(日本SANYO公司)；自動電泳凝膠成像分析儀為美國synge

6、ne公司生產(chǎn)；PCR擴增儀PTC-100TM為美國公司生產(chǎn)。 二、方法 免疫組化方法采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)(SP)法：取石蠟切片，烤片，68℃，20分鐘，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水；二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20 min-100％酒精Ⅰ10min-100％Ⅱ 10min-95％5min-80％5min-70％5min；阻斷滅活內(nèi)源性過氧化物酶：3％H2O2 37℃孵育10min，PBS沖洗3X5min

7、；抗原修復：置0.01M枸櫞酸緩沖液(PH 6.0)中用煮沸(95℃，15-20min)，自然冷卻20min以上，再用冷水沖洗缸子，加快冷卻至室溫，PBS沖洗3X5min。正常羊血清工作液封閉，37℃10 min，傾去勿洗；滴加一抗4℃冰箱孵育過夜，PBS沖洗3X5min(用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照)；滴加生物素標記二抗，37℃孵育30min，PBS沖洗3X5min：滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液，37℃孵育30min

8、，PBS沖洗3X5min；DAB/H2O2反應染色，自來水充分沖洗后蘇木素復染，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片。 RT-PCR方法：提取組織總RNA，按TROZOL抽提試劑盒說明進行，紫外分光光度儀檢測RNA純度及濃度。逆轉(zhuǎn)錄反應：在20ul逆轉(zhuǎn)錄反應體系中含總RNA(1ug/ul)1ul，0ligo(dT)15，引物0.5ul，25mM MgSO42ul，10mMdNTPs 0.5ul，2×buffer 5ul，RNA Inhib

9、itor 0.25ul，反轉(zhuǎn)錄酶(22U/ul)0.5ul，dd.H2O0.25ul。反應條件：65℃ 1min，30℃5min，15-30min勻速升溫至65℃，65℃ 30min，98℃ 5min終止反應，5℃ 5min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。擴增c-FLIP cDNA：取cDNA3ul，上下游引物各0.1ul，Taq DNA聚合酶0.2ul，加入PCR反應體系中擴增，反應條件：94℃變性3min，94℃45s，54.2℃1min，72℃1m

10、in 35cycls，72℃7min延伸。PCR產(chǎn)物分析：PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠成像及分析系統(tǒng)掃描后，以β-actin為參照求出其相對值?；虮磉_值(％)=(c-FLIP/β-actin)×100。引物序列：c-FLIP F，5’-GTT CTT CGG GAC ACC TTC AGT-3’，R，5’-TAT CCA CGC CAA ACA CGC TCT-3。Β-actin F，5’-GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA-3

11、’R，5’-CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3’ 三、結(jié)果判定及統(tǒng)計學處理 c-FLIP蛋白染色為棕黃色顆粒，定位于細胞漿內(nèi)。每張切片隨機選擇觀察10個高倍視野，每個高倍視野計數(shù)100個細胞并計算平均數(shù)，c-FLIP的表達以著色腫瘤細胞平均數(shù)大于10％為陽性引入標準。 RT-PCR結(jié)果采用t檢驗，P<0.05有統(tǒng)計學意義。在預后的研究過程中主要探討c-FLIP mRNA表達與患者術

12、后無病生存率DFS(disease free survival)之間的關系。DFS定義為自隨訪之日起至患者出現(xiàn)復發(fā)灶，或因該病發(fā)生死亡的時間。采用Kaplan-meier進行單因素分析，COX風險模型進行多因素分析。所有的統(tǒng)計計算應用spss13.0軟件。 結(jié)果： 一、c-FLIP蛋白在膀胱移行細胞癌中的表達。 C-FLIP蛋白呈棕黃色顆粒，定位于胞漿。膀胱癌組織中FLIP蛋白的陽性率為76.77％(23/30)

13、，正常膀胱移行上皮c-FLIP蛋白表達為陰性。 二、c-FLIP mRNA在膀胱移行細胞癌中的表達。 RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳后，紫外透射儀下可見到擴增的特異產(chǎn)物條帶，目的基因片段產(chǎn)物與引物設計目的片段大小完全吻合。30例癌組織標本中19例呈陽性表達，陽性率63.3％，10例對照均呈陰性表達。 三、c-FLIP mRNA在膀胱移行細胞癌組織及正常膀胱上皮組織的檢測結(jié)果。 顯示膀胱移行細胞癌組織

14、及正常膀胱上皮組織中c-FLIP mRNA表達結(jié)果，兩者比較，差異顯著(P<0.05)。 四、c-FLIP mRNA的表達與臨床分期、病理組織分級之間的關系。 顯示膀胱移行細胞癌組織中c-FLIP mRNA表達與其臨床分期、病理分級之間差異不顯著(P>0.05)。 五、c-FLIP mRNA 的表達與膀胱移行細胞癌預后之間關系。 在膀胱移行細胞癌的預后過程中，癌組織的臨床分期與病理組織分級及單發(fā)或多發(fā)對患

15、者的術后無病生存率DFS無顯著性影響，(P>0.05)。癌組織的c-FLIP mRNA的表達情況對患者的DFS存在顯著性影響，RR=5.397，95％CI(1.148-25.377)，P=0.033。提示c-FLIP mRNA呈陽性表達的患者術后無病生存率較低，預后不好。 結(jié)論： 1、c-FLIP蛋白與c-FLIP mRNA在膀胱移行細胞癌中呈一致高表達。 2、c-FLIP mRNA在膀胱移行細胞癌中高表達，這一