人表皮干細(xì)胞定位、分離培養(yǎng)與端粒酶表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、一、研究目的: (1)研究不同發(fā)育階段人表皮干細(xì)胞定位與端粒酶表達(dá)特征，探討這些特征對(duì)燒傷創(chuàng)面修復(fù)的臨床意義。 (2)研究人表皮干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)及鑒定方法，比較在體外培養(yǎng)條件下不同發(fā)育階段人表皮干細(xì)胞端粒酶活性表達(dá)差異，為表皮干細(xì)胞在皮膚組織工程中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 二、研究方法: 第一部分、表皮干細(xì)胞的定位與端粒酶表達(dá)檢測。 取因創(chuàng)傷等原因致意外流產(chǎn)的胎兒皮膚和少兒、成年人燒傷整形植皮手術(shù)剩余

2、皮片標(biāo)本，取材后立即用10％中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，4℃保存待測。所有標(biāo)本經(jīng)系列切片后，分別采用鼠抗人整合素β1(integrinβ1)、角蛋白19(keratin19，K19)、p63轉(zhuǎn)錄因子(p63 transcription factor)、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶催化亞基(telomerase reverse transcriptase catalytic subunit，TERT)單克隆抗體作為一抗，以免疫組織化學(xué)EnVisio

3、n法檢測皮膚組織中表皮干細(xì)胞標(biāo)志物整合素β1、角蛋白19、p63轉(zhuǎn)錄因子和TERT的表達(dá)，200倍光鏡下觀察免疫組化結(jié)果，測定陽性表達(dá)率。 第二部分、表皮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)、鑒定及端粒酶活性表達(dá)檢測。 取因創(chuàng)傷等原因致意外流產(chǎn)的胎兒皮膚，用胰蛋白酶和EDTA聯(lián)合消化法分離表皮，用Ⅳ型膠原快速粘附法分離、純化人表皮干細(xì)胞，以含表皮生長因子、角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)液等組成的人表皮干細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行體外培養(yǎng)。通過計(jì)算其克隆形成率、細(xì)胞

4、周期測定及免疫細(xì)胞化學(xué)染色法β1整合素、K19、p63單抗檢測等對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。均以角質(zhì)細(xì)胞作對(duì)照。以免疫細(xì)胞化學(xué)染色法和圖像分析法檢測體外培養(yǎng)的胎兒皮膚、少兒皮膚和成年人皮膚表皮干細(xì)胞端粒酶活性表達(dá)。 三、研究結(jié)果： 第一部分 胎兒皮膚、少兒皮膚和成年人皮膚表皮的基底部、毛囊周圍細(xì)胞均可見β1整合素、K19、p63和TERT呈棕黃色陽性表達(dá)。胎兒表皮基底層細(xì)胞β1整合素、K19和p63均為強(qiáng)陽性；少兒表皮基

5、底層細(xì)胞中大部分細(xì)胞表達(dá)β1整合素、K19和p63陽性細(xì)胞均勻分布：成年人表皮基底層β1整合素、K19和p63弱陽性表達(dá)，陽性細(xì)胞散在分布，且呈相對(duì)集中片狀分布，陽性細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)度較胎兒組、少兒組低。 胎兒皮膚、少兒皮膚和成人皮膚端粒酶免疫組化染色均呈陽性，陽性細(xì)胞主要集中于表皮基底層。其中，胎兒表皮基底層陽性細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)度較少兒表皮和成人表皮強(qiáng)，少兒次之，成人表皮表達(dá)最弱。 胎兒皮膚、少兒皮膚與成年人皮膚β1整合素、K19

6、、p63和TERT陽性表達(dá)率均隨年齡增加而呈下降趨勢，組間差異有非常顯著性意義(P＜0.01)。 第二部分 分離培養(yǎng)的人表皮干細(xì)胞呈明顯克隆性生長，其克隆形成率明顯高于對(duì)照組，組間差異有顯著性意義(P＜0.05)。細(xì)胞周期檢測發(fā)現(xiàn)，人表皮干細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例明顯高于角質(zhì)細(xì)胞組，組間差異有顯著性意義(P＜0.05)。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測顯示，分離培養(yǎng)的人表皮干細(xì)胞β1整合素、K19和p63呈陽性表達(dá)，角質(zhì)細(xì)胞對(duì)照組表達(dá)陰

7、性。 分離培養(yǎng)的人胎兒皮膚來源表皮干細(xì)胞、少兒皮膚來源表皮干細(xì)胞、成人皮膚來源表皮干細(xì)胞端粒酶活性表達(dá)均呈陽性。但表達(dá)強(qiáng)度不同，其表達(dá)強(qiáng)弱依次人胎兒皮膚來源表皮干細(xì)胞、少兒皮膚來源表皮干細(xì)胞、成人皮膚來源表皮干細(xì)胞。圖像分析法檢測各組細(xì)胞平均吸光度值和陽性面積值，結(jié)果顯示：胎兒組、少兒組、成人組表皮干細(xì)胞平均吸光度值和陽性面積值均隨年齡增加而逐漸降低，組間差異有顯著性意義(P＜0.05)。 四、研究結(jié)論： (1)

8、胎兒皮膚、少兒皮膚和成人皮膚表皮干細(xì)胞主要位于表皮基底層，端粒酶表達(dá)陽性區(qū)域及信號(hào)強(qiáng)度與表皮干細(xì)胞的定位分布及陽性表達(dá)強(qiáng)度相一致。提示表皮干細(xì)胞的數(shù)量、端粒酶活性表達(dá)的強(qiáng)弱可能與不同發(fā)育階段皮膚組織的修復(fù)能力差異密切相關(guān)。 (2)本實(shí)驗(yàn)采用胰蛋白酶和EDTA聯(lián)合消化法分離表皮、用Ⅳ型膠原快速粘附法分離培養(yǎng)人表皮干細(xì)胞，細(xì)胞呈明顯克隆性生長，G0/G1期細(xì)胞比例高，β1整合素、K19和p63免疫細(xì)胞化學(xué)染色均呈陽性表達(dá)。表明在本實(shí)