lncRNA與mRNA在雞ALV-J病毒感染中的表達規(guī)律研究.pdf

1、禽白血病(Avian Leukosis，AL)是由禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus，ALV)和禽肉瘤病病毒(Avian Sarocma Virus，RSV)引起的禽類多種腫瘤性疾病的統(tǒng)稱。在家禽生產(chǎn)中，該疾病主要引起雞群產(chǎn)蛋率下降、死亡率上升、肉品質(zhì)降低，同時嚴重影響機體免疫系統(tǒng)，表現(xiàn)出中樞免疫器官萎縮和抵抗力明顯下降，繼而增加其他疾病的感染幾率。近年來，ALV-J作為一種主要流行的禽白血病病毒，嚴重危害著養(yǎng)殖業(yè)的

2、健康發(fā)展，給中國乃至世界養(yǎng)雞業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失，至今還沒有有效控制禽白血病的疫苗和藥物。目前主要通過種群凈化來控制疾病，但這種方法存在著成本高、周期長、受外界環(huán)境影響大等弊端。因此，迫切需要從遺傳上探明ALV-J的感染機制以及尋找防治ALV-J的方法。本研究利用Illumina HiSeq2500高通量測序技術(shù)，分別在體內(nèi)和體外水平對ALV-J感染的雞源細胞以及病雞組織樣進行全轉(zhuǎn)錄組測序，篩選出病毒感染過程中的關(guān)鍵差異mRNA和ln

3、cRNA，探討lncRNA在病毒感染過程中的可能作用機制，從而為尋找禽白血病的腫瘤標記物以及家禽抗病育種提供理論基礎(chǔ)。主要研究內(nèi)容如下:
　　1、為探討雞免疫細胞和體細胞感染ALV-J后病毒復制與宿主細胞生物學特性的變化，本研究利用雞巨噬細胞(HD11)與成纖維細胞(CEF)為素材，分別接種100個TCID50的ALV-J病毒，并在1dpi、2dpi、3dpi、4dpi、5dpi、7dpi檢測了細胞中的病毒拷貝數(shù)、細胞活力、細胞凋

4、亡率三個指標。結(jié)果表明，CEF細胞中的病毒拷貝數(shù)在4dpi時顯著上升(P＜0.05)，HD11細胞中病毒拷貝數(shù)在5dpi時出現(xiàn)顯著上升(P＜0.05）;CEF細胞活力在5dpi后出現(xiàn)顯著上升（P＜0.05），而HD11細胞則在4dpi前顯著上升(P＜0.05）;兩種細胞的凋亡率均是隨時間延長而增加，在3dpi時達到最大，隨后出現(xiàn)下降。
　　2、基于細胞生物學檢測結(jié)果，我們選取了1dpi、4dpi、7dpi三個時間點，利用RNA-s

5、eq技術(shù)對兩種細胞進行全轉(zhuǎn)錄組測序。通過對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，我們分別獲得了336和269個差異表達基因。經(jīng)過熒光定量驗證后將這些差異表達基因進行功能注釋分析，發(fā)現(xiàn)多條信號通路與免疫反應相關(guān)，如先天性免疫反應（OASL，CCL4），適應性免疫反應(LYZ,CD72），凋亡與自噬（WISP2,COMP），炎癥反應(JSC,IL8），腫瘤形成相關(guān)(PCNA，GPX3）。
　　3、為挖掘轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的lncRNA信息，利用cuffinks等

6、生物信息學軟件對lncRNA進行了比對、預測，共獲得了12103條lncRNA。通過對差異表達的lncRNA進行順式(Cis)和反式(Trans)預測，在CEF細胞中，差異lncRNA所預測的靶基因被富集到多個與先天性免疫和炎癥反應相關(guān)的通路中(ISG15-protein conjugation，innate immune response);而在HD11細胞中，多被富集到血管生成、細胞外基質(zhì)等通路(negative regulatio

7、n of autophagy，T cell activation)。通過IncRNA與mRNA共表達分析，發(fā)現(xiàn)NONGGAT007033.2，TCONS_00143593，TCONS_00286311等多個lncRNA與CNN2, MMP2, CD72, CCL4, IL-1等免疫相關(guān)基因存在顯著共表達關(guān)系。
　　4、為了進一步探索ALV-J在機體感染中的轉(zhuǎn)錄組變化情況，從實際生產(chǎn)中篩選出只感染ALV-J與健康個體各3只，對其脾臟