原發(fā)性膽汁性肝硬化患者lncRNA表達(dá)譜芯片分析及功能研究.pdf

1、長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)是指核苷酸長(zhǎng)度大于200個(gè)堿基的不具有蛋白質(zhì)編碼功能的RNA分子。起初認(rèn)為lncRNA不具備生物學(xué)功能，但是越來(lái)越多的研究證實(shí)lncRNA經(jīng)折疊后可以形成特定的空間結(jié)構(gòu)，在表觀遺傳層面、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后修飾層面以及翻譯過(guò)程中調(diào)控特定基因的表達(dá)，在許多生理和病理過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。已有不少研究證實(shí)了肝癌、胃癌、前列腺癌中l(wèi)ncRNA存在異常表達(dá)或序列突變，參與腫瘤的增

2、殖、侵襲、轉(zhuǎn)移;并且還可作為腫瘤診斷、分期、預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)。lncRNA在免疫細(xì)胞分化、固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中同樣發(fā)揮重要調(diào)控作用。lnc-DC只在人類樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendriticcells，DC)中特異性表達(dá)，通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子STAT3(Signal transducer and activator oftranscription3)結(jié)合，促進(jìn)單核細(xì)胞向DC分化，同時(shí)增強(qiáng)DC活化T細(xì)胞的能力。X染色體上存在許多與機(jī)體免疫功能相

3、關(guān)的基因如腫瘤壞死因子a(Tumor necrosisfactor-a，TNF-a)、CD40配體（Cell differentiation ligand，CD40L）、叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子P3（Forkhead box P3，F(xiàn)OXP3），而長(zhǎng)鏈非編碼RNA Xist(X inactive specifictranscript，Xist)參與X染色體失活過(guò)程，Xist的序列結(jié)構(gòu)或功能的改變可能導(dǎo)致X染色體上免疫相關(guān)基因的表達(dá)異常，這或許可以

4、部分解釋許多自身免疫性疾病中女性易感的現(xiàn)象。
　　原發(fā)性膽汁性肝硬化（Primary biliary cirrhosis，PBC）是一種以肝內(nèi)中、小膽管損傷導(dǎo)致膽汁淤積，同時(shí)患者血清出現(xiàn)疾病特異的抗線粒體抗體(Anti-mitochondrial antibody，AMA)，并伴有堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（Gamma glutamyl transferase，GGT）等生化指標(biāo)升

5、高為主要特征的器官特異性自身免疫性疾病，好發(fā)于中老年女性，近年來(lái)隨著自身抗體檢測(cè)的普及和應(yīng)用，發(fā)病率在逐年上升。感染、環(huán)境因素、遺傳因素以及表觀遺傳學(xué)因素等均有可能參與PBC的發(fā)病，但具體發(fā)病機(jī)制仍不明確。
　　對(duì)于lncRNA在PBC中的研究目前還相對(duì)較少，無(wú)論是肝組織還是外周血中。本課題對(duì)PBC患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中l(wèi)ncRNA表達(dá)譜的研究可以為P

6、BC的發(fā)病機(jī)理提供新的思路，也可以為PBC的臨床診斷、治療提供新的途徑。
　　第一部分:PBC患者lncRNA表達(dá)譜芯片分析及RT-PCR驗(yàn)證
　　本部分研究收集PBC及健康對(duì)照組外周抗凝血各30例，分離PBMC，從中各選取4例進(jìn)行l(wèi)ncRNA表達(dá)譜芯片測(cè)定，旨在利用芯片篩選出PBC患者PBMC中差異表達(dá)的lncRNA，并用RT-PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果。相比健康對(duì)照組，PBC組中共發(fā)現(xiàn)749個(gè)異常表達(dá)的lncRNA，其中541個(gè)

7、上調(diào)，208個(gè)下調(diào)。230個(gè)異常表達(dá)的mRNA，其中184個(gè)上調(diào)，46個(gè)下調(diào)。從差異表達(dá)的lncRNA譜中選取6個(gè)(uc003xrr、uc010nhz、p1102447、NR_026777、ENST00000442026、ENST00000431157)擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證芯片結(jié)果的可靠性，結(jié)果這6個(gè)差異的lncRNA在PBC組中的表達(dá)水平與芯片結(jié)果相符合。
　　第二部分:lncRNA表達(dá)譜芯片生物信息學(xué)分析
　　本部分主要通過(guò)對(duì)

8、第一部分得到的749個(gè)差異lncRNA進(jìn)行Cis-/Trans-靶基因的GO(Gene ontology，GO)、Pathway分析，以及構(gòu)建lncRNA與mRNA的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖，分析這些異常表達(dá)的lncRNA參與的細(xì)胞功能和信號(hào)通路，為進(jìn)一步探究lncRNA在PBC中的作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)，指明研究方向。結(jié)果Cis/trans靶基因pathway分析提示這些差異表達(dá)的lncRNA作用的靶基因主要是與細(xì)胞凋亡及代謝途徑相關(guān)。NR4A核受

9、體亞家族廣泛參與各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如MAKP、NF-KB、PI3K/JNK、Wnt等，調(diào)控細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、脂質(zhì)代謝、血管形成以及DNA損傷修復(fù)等多種細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程。縱觀芯片中各基因的mRNA表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，其成員之一NR4A3基因的表達(dá)水平下調(diào)0.22倍，P值為0.0082。綜合分析芯片上各位點(diǎn)的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)NR4A3基因下游2萬(wàn)bp左右的位置處lncRNALOC441461的表達(dá)水平與其相反，上調(diào)2.56倍，P值為0.0

10、015。綜合三個(gè)權(quán)威數(shù)據(jù)庫(kù)的結(jié)果確定LOC446C61為非編碼RNA。在CatRapid網(wǎng)站在線預(yù)測(cè)LOC441461與PRC2復(fù)合物結(jié)合的可能性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在LOC441461的核苷酸序列第439-554核苷酸位置處存在PRC2復(fù)合物的結(jié)合位點(diǎn)，其中451-552位置處的辨識(shí)度高達(dá)94％，預(yù)示它們之間極有可能發(fā)生相互作用。因此，我們猜想PBC患者中LOC441461或許通過(guò)招募PRC2復(fù)合物，使NR4A3基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化，進(jìn)而下調(diào)NR

11、4A3基因的表達(dá)水平，觸發(fā)一系列生物學(xué)效應(yīng)，促進(jìn)疾病的發(fā)生發(fā)展。
　　第三部分:linc-pbc靶點(diǎn)驗(yàn)證及功能探究
　　本部分我們檢測(cè)了linc-pbc和NR4A3在PBC組、疾病對(duì)照組和健康對(duì)照組中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在PBC組中這兩者的表達(dá)水平與芯片結(jié)果相符，P＜0.001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)患者中l(wèi)inc-pbc及NR4A3的表達(dá)模式與PB

12、C類似，而乙肝肝硬化（Hepatitis B virus，HBV）患者中這二者的表達(dá)水平與對(duì)照組無(wú)顯著性差異。設(shè)計(jì)siRNA對(duì)linc-pbc進(jìn)行干擾，觀察NR4A3、FOXP3的mRNA以及蛋白表達(dá)水平的是否有變化。同時(shí)檢測(cè)轉(zhuǎn)染siRNA后PBMC的凋亡情況。本研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染針對(duì)linc-pbc的siRNA后，PBMC中l(wèi)inc-pbc的水平下降，而NR4A3的mRNA表達(dá)水平及蛋白質(zhì)水平均上調(diào)，F(xiàn)OXP3的水平也上調(diào)，這說(shuō)明linc-

13、pbc可能確實(shí)可以通過(guò)與PRC2復(fù)合物結(jié)合，抑制NR4A3的表達(dá);而NR4A3表達(dá)水平的降低將導(dǎo)致其調(diào)控轉(zhuǎn)錄的活性降低，進(jìn)一步引起下游靶基因FOXP3的表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致循環(huán)外周血液及肝臟組織局部具有免疫抑制功能的Treg細(xì)胞減少，打破機(jī)體免疫耐受平衡狀態(tài)，從而誘發(fā)疾病。但另一方面，轉(zhuǎn)染siRNA后，細(xì)胞凋亡水平與陰性對(duì)照組并無(wú)明顯差異，可能是由于轉(zhuǎn)染的PBMC是從健康人中分離的，而這些健康人的細(xì)胞可能存在一定的損傷修復(fù)機(jī)制，單獨(dú)干擾lin

14、c-pbc雖然可以使NR4A3的表達(dá)上升，但可能尚不足以引起明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。又或者，NR4A3僅僅促進(jìn)自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的凋亡。
　　結(jié)論：PBC患者PBMC中，相對(duì)于健康對(duì)照組，共發(fā)現(xiàn)749個(gè)異常表達(dá)的lncRNA，其中541個(gè)上調(diào)，208個(gè)下調(diào)。230個(gè)異常表達(dá)的mRNA，其中184個(gè)上調(diào)，46個(gè)下調(diào)。NR4A3基因的表達(dá)水平下調(diào)0.22倍，P值為0.0082。在NR4A3基因下游的lncRNA LOC441461的表達(dá)