GLS-IL-12重組沙門菌抗腫瘤的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、腫瘤是一類嚴(yán)重危害健康、影響生活質(zhì)量的重大疾病。目前全球每年因癌癥死亡的人數(shù)約為760萬，70％以上發(fā)生在低收入和中等收入國家。在我國腫瘤死亡已位居各類死因第一位，每年死于腫瘤的人數(shù)約150萬?；蛑委熓墙陙?，隨著細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)理論和技術(shù)的飛速發(fā)展繼手術(shù)治療、放射治療和化學(xué)治療后的一種新型治療手段。目前，腫瘤的基因治療已成為備受矚目的研究領(lǐng)域。 課題設(shè)計(jì)構(gòu)建了能分泌表達(dá)促凋亡因子(GLS)和免疫調(diào)節(jié)因子(白細(xì)胞介素-1

2、2)的真核共表達(dá)質(zhì)粒pBudCE4.1-S9K/mlL-12，并構(gòu)建了能將該質(zhì)粒遞送到腫瘤組織的重組沙門菌，在小鼠黑色素瘤模型上觀察了局部注射和口服給予重組沙門菌的抗瘤作用。 第一部分人GLS活性肽和小鼠IL-12基因真核共表達(dá)質(zhì)粒pBudCE4.1-S9K/mIL-12的構(gòu)建及表達(dá) 目的：構(gòu)建能分泌表達(dá)人GLS活性肽和小鼠IL-12的真核共表達(dá)質(zhì)粒pBudCE4.1-S9K/mIL-12，并檢測其表達(dá)。 方法：

3、將 GLS 分泌肽的編碼序列加入到引物序列中，以含GLS基因(不含分泌肽)的質(zhì)粒pZMO3為模板，采用PCR擴(kuò)增出含分泌肽基因的人GLS活性肽基因。然后定向克隆入真核共表達(dá)質(zhì)粒pBudCE4.1的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建GLS活性肽的真核表達(dá)質(zhì)粒pBudCE4.1-S9K，測序確認(rèn)正確。將其轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，以反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)和免疫細(xì)胞化學(xué)法分別檢測mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)。將質(zhì)粒pZMO2中的小鼠白細(xì)胞介素12(murine ime

4、rleuldn 12,mlL-12)亞克隆到pBudCE4.1-S9K，構(gòu)建真核共表達(dá)質(zhì)粒pBudCE4.1-S9K/mIL-12。轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，以RT-PCR，DOT-ELISA和ELISA檢測試劑盒檢測GLS和mIL-12的表達(dá)與分泌。 結(jié)果：成功擴(kuò)增出含分泌肽編碼序列的人GLS活性肽基因。構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒pBudCE4.1-S9K經(jīng)PCR，雙酶切和雙向測序鑒定基因序列完全正確。pBudCE4.1-S9K轉(zhuǎn)染細(xì)胞，經(jīng)RT-P

5、CR擴(kuò)增出特異性267bp左右的目的條帶；經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)檢測到轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)明顯的棕黃色表達(dá)顆粒。真核共表達(dá)質(zhì)粒pBudCE4.1-S9K/mIL-12轉(zhuǎn)染細(xì)胞，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增出特異性267bp和1632bp左右的GLS基因和mIL-12基因條帶；轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清中用ELISA試劑盒檢測到mIL-12的分泌；轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清用DOT-ELISA檢測出現(xiàn)明顯的斑點(diǎn)。 結(jié)論：成功構(gòu)建能分泌表達(dá)人GLS活性肽和小鼠IL-12的真核共表達(dá)質(zhì)粒p

6、BudCE4.1-S9K/mIL-12。 第二部分人GLS活性肽和小鼠IL-12基因真核共表達(dá)質(zhì)粒pBudCE4.1-S9K/mIL-12的體外抗瘤效應(yīng) 目的：檢測人GLS活性肽和小鼠IL-12基因的真核共表達(dá)質(zhì)粒pBudCE4.1-S9K/mIL-12對腫瘤細(xì)胞的影響。 方法：將pBudCE4.1-S9K/mIL-12轉(zhuǎn)染小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16，先以RT-PCR檢測腫瘤細(xì)胞內(nèi)GLS的表達(dá)，然后采用MTT法檢測其

7、對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用；用Hoechst 33258，細(xì)胞壞死/凋亡/正常細(xì)胞鑒別試劑盒(AO/EB)染色觀測腫瘤細(xì)胞的凋亡；用Annexin Ⅴ-FITC和碘化丙啶雙染檢測細(xì)胞凋亡早期細(xì)胞膜的變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡細(xì)胞的數(shù)量。 結(jié)果：用RT-PCR檢測到GLS在B16中表達(dá)的特異性條帶。MTT法檢測，GLS明顯抑制腫瘤細(xì)胞增殖，抑制率達(dá)到34.27％。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h，用Annexin Ⅴ-FITC和碘化丙啶雙染，流式細(xì)胞儀

8、檢測，轉(zhuǎn)染pBudCE4.1-S9K/mIL-12質(zhì)粒的腫瘤細(xì)胞處于凋亡期的比率為21.02％，比空質(zhì)粒對照(凋亡率5.45％)增高了約15.57％。轉(zhuǎn)染pBudCE4.1-S9K/mIL-12的腫瘤細(xì)胞，72h后細(xì)胞出泡，細(xì)胞核濃縮，致密，碎塊狀，Hoechst 33258染色成亮藍(lán)色，平均凋亡指數(shù)達(dá)31.40±4.01％；而空質(zhì)粒對照細(xì)胞核形態(tài)正常，染色淺淡，凋亡指數(shù)為5.70±1.64％。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)和72小時(shí)，腫瘤細(xì)胞經(jīng)AO/

9、EB染色在熒光顯微鏡下區(qū)分正常細(xì)胞、壞死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。正常細(xì)胞被染成綠色，細(xì)胞與胞核形態(tài)正常。壞死細(xì)胞由于失去了核膜的完整性，細(xì)胞核被溴化乙錠染成紅色。而凋亡細(xì)胞胞特有膜外翻、膜出泡、棒狀或芽狀突起等形態(tài)，細(xì)胞被染成橙色，核形態(tài)不規(guī)則。細(xì)胞凋亡率為32.80±4.83％。 結(jié)論：pBudCE4.1-S9K/mIL-12轉(zhuǎn)染小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16，能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。 第三部分?jǐn)y帶人GLS活性肽和小鼠

10、IL-12基因的重組沙門菌的構(gòu)建 目的：構(gòu)建攜帶人GLS活性肽與小鼠IL-12基因的重組沙門菌，并鑒定該重組菌向真核細(xì)胞遞呈質(zhì)粒的能力。 方法：制備沙門菌感受態(tài)，以電轉(zhuǎn)化的方式將pBudCE4.1-S9K/mIL-12質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)菌構(gòu)建重組沙門菌，抽提質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定重組菌；并在含Zeocin抗生素的低鹽LB平板上反復(fù)傳代培養(yǎng)，鑒定沙門菌攜帶質(zhì)粒的穩(wěn)定性。以相同方法構(gòu)建含pBudCE4.1，pBudCE4.1-S9K，p

11、BudCE4.1/mIL-12質(zhì)粒的重組沙門菌作為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對照菌。將質(zhì)粒pEGFP-C1和pEGFP-C1/S9K轉(zhuǎn)入沙門菌，然后感染小鼠巨噬細(xì)胞，通過RT-PCR．和細(xì)胞熒光表達(dá)觀察反映重組菌向真核細(xì)胞遞呈質(zhì)粒的能力。用pBudCE4.1-S9K重組沙門菌感染黑色素瘤細(xì)胞B16，48h后提取細(xì)胞總RNA，用RT-PCR法擴(kuò)增GLS基因條帶，了解沙門菌感染黑色素瘤細(xì)胞的能力。 結(jié)論：成功構(gòu)建含pBudCE4.1-S9K/mIL-

12、12的重組沙門菌及含pBudCE4.1，pBudCE4.1-S9K，pBudCE4.1-mIL-12質(zhì)粒的重組沙門菌。攜帶質(zhì)粒的重組沙門菌能穩(wěn)定傳代15代。重組沙門菌能向小鼠巨噬細(xì)胞遞呈攜帶基因。重組沙門菌對小鼠黑色素瘤細(xì)胞有一定的感染能力。 第四部分?jǐn)y帶GLS與IL-12真核共表達(dá)質(zhì)粒重組沙門菌局部注射抗腫瘤實(shí)驗(yàn) 目的：建立小鼠黑色素瘤模型，觀察含pBudCE4.1-S9K/mIL-12的重組沙門菌局部瘤內(nèi)注射的抗瘤效

13、果。 方法：C57BL/6J純系小鼠于前肢右側(cè)腋下皮下接種腫瘤細(xì)胞B16，每鼠10<'6>細(xì)胞(0.1ml細(xì)胞懸液)，待腫瘤長到1cm大小時(shí)，取瘤組織病理切片HE染色確認(rèn)腫瘤模型。以10<'4>/ml，10<'6>/ml，10<'8>/ml，10<'10>/ml瘤內(nèi)注射0.1ml觀測腫瘤生長情況，確定治療劑量。以腫瘤接種后1，4，7，10天開始治療，確定治療起始時(shí)間。治療分6組，分別用PBS，沙門菌，含pBudCE4.1，pBu

14、dCE4.1-S9K，pBudCE4.1/mIL-12，pBudCE4.1-S9K/mIL-12質(zhì)粒的重組沙門菌進(jìn)行瘤內(nèi)注射治療，從腫瘤接種后1天開始治療，每次0.1ml(10<'8>/ml)，一周一次共4次。隔日觀察腫瘤生長情況，測量腫瘤大小和觀察帶瘤存活期。取小鼠血清用ELISA試劑盒檢測IFN-Y和IL-12的變化。取腫瘤組織行病理切片HE染色觀察腫瘤病理變化。 結(jié)論：攜帶pBudCE4.1-S9K/mIL-12質(zhì)粒的重組

15、沙門菌瘤內(nèi)注射對小鼠黑色素瘤有一定的治療作用。 第五部分口服給藥觀察GLS與IL-12真核共表達(dá)質(zhì)粒重組沙門菌體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng) 目的：探討口服給予含pBudCE4.1-S9K/mIL-12質(zhì)粒的重組沙門菌對小鼠黑色素瘤的抗瘤效果。 方法：C57BL/6J純系小鼠于前肢右側(cè)腋下皮下接種腫瘤細(xì)胞B16，每鼠10<'6>細(xì)胞(0.1ml細(xì)胞懸液)，建立小鼠黑色素瘤模型。口服pEGFP-C1重組沙門菌，48小時(shí)后，解剖取出

16、瘤體組織，固定，切片，于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達(dá)情況了解沙門菌的腫瘤靶向性。治療分6組，分別用PBS，沙門菌，含pBudCE4.1，pBudCE4.1-S9K，pBudCE4.1/mIL-12，pBudCE4.1-S9K/mIL-12質(zhì)粒的重組沙門菌進(jìn)行灌胃治療，從接種腫瘤細(xì)胞即開始治療，每次0.1ml(10<'9>/ml)，每周一次，共4次。隔日觀察腫瘤生長情況，測量腫瘤大小和帶瘤存活期。取小鼠血清用ELISA試劑盒檢測IFN-γ

17、和IL-12的變化。取腫瘤組織行病理切片HE染色觀察腫瘤病理變化。 結(jié)果：口服pEGFP-C1重組沙門菌48小時(shí)后，在腫瘤組織觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá)。與PBS組和沙門菌組相比，用pBudCE4.1-S9K/mIL-12重組沙門菌進(jìn)行治療，腫瘤生長受抑制，腫瘤體積較小(p<0.05)；小鼠血清中的IL-12和IFN-γ升高(p<0.05)；帶瘤存活期延長；病理檢測可見腫瘤組織有壞死和淋巴細(xì)胞的浸潤。 結(jié)論：攜帶pBudC