重組恥垢分枝桿菌 rMS-Ag85a-IL-17a在非嗜酸性粒細(xì)胞型哮喘中的作用與機(jī)制.pdf

1、背景：隨著對(duì)支氣管哮喘臨床與機(jī)制的深入研究，發(fā)現(xiàn)近半數(shù)的哮喘患者表現(xiàn)為非嗜酸性粒細(xì)胞型哮喘（non-eosinophilic asthma，NEA），其氣道炎癥以多形核中性粒細(xì)胞（polymorphonuclear neutrophil，PMN）浸潤(rùn)為主，往往對(duì)糖皮質(zhì)激素（glucocorticoids，GC）治療不敏感。IL-17是一種重要的前炎癥因子，可刺激效應(yīng)細(xì)胞表達(dá)多種PMN的趨化因子，引起PMN的聚集及炎癥反應(yīng)。因此，阻斷IL

2、-17A或可減輕NEA氣道炎癥。我們已成功構(gòu)建了rMS-Ag85a-IL-17a疫苗，并證明該疫苗可誘導(dǎo)生成IL-17A自身抗體，在重癥哮喘模型的治療中取得了相當(dāng)?shù)寞熜?。本?shí)驗(yàn)擬構(gòu)建小鼠NEA模型，進(jìn)一步研究rMS-Ag85a-IL-17a拮抗NEA氣道炎癥的作用與相關(guān)機(jī)制。
　　目的：rMS-Ag85a-IL-17a免疫小鼠，誘導(dǎo)生成IL-17A自身抗體，體外提取純化，探討其抑制PMN的功能及抗NEA的氣道炎癥的作用與機(jī)制。

3、r>　　方法：本實(shí)驗(yàn)分四部分：（1）NEA模型的復(fù)制建立及 PMN的作用：以DO11.10小鼠復(fù)制建立NEA模型，觀察PMN在NEA和EA模型中的作用。肺泡灌洗液（BALF）分類計(jì)數(shù)，觀察PMN數(shù)目；ELISA法檢測(cè)BALF中IL-4、IFN-γ、IL-17A、IL-6、CXCL-1、CXCL-2的表達(dá)水平；RT-PCR檢測(cè)肺組織中ENA-78、NAP-2、NE的mRNA表達(dá)情況；測(cè)定BALF及肺組織中MPO活性。（2） rMS-Ag8

4、5a-IL-17a免疫方案的建立及提取純化 IL-17A自身抗體：rMS-Ag85a-IL-17a經(jīng)鼻腔免疫小鼠，ELISA法動(dòng)態(tài)檢測(cè)血清IL-17A自身抗體的滴度，在表達(dá)高峰時(shí)段分次大量提取血清，蛋白質(zhì)A親和層析法純化IL-17A自身抗體，紫外分光光度法測(cè)定純化抗體的濃度，SDS-Page鑒定抗體的完整性和穩(wěn)定性，ELISA法測(cè)定抗體的活性。（3）IL-17A自身抗體抑制PMN趨化：Transwell下室接種RAW264.7細(xì)胞，商品

5、化IL-17A重組蛋白刺激，純化的IL-17A自身抗體進(jìn)行阻斷，上室加入提取的小鼠外周血 PMN，MTT法間接測(cè)量穿過(guò)小室的PMN數(shù)目，ELISA法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清中CXCL-1、CXCL-2的分泌水平，結(jié)果與PBS組、IL-17A組及IL-17A自身抗體組進(jìn)行比較，觀察IL-17A自身抗體抑制PMN的趨化作用，Western blot檢測(cè)IL-17A自身抗體對(duì)趨化因子轉(zhuǎn)錄途徑的影響。（4）rMS-Ag85a-IL-17a抗NEA氣道炎

6、癥反應(yīng)的作用與機(jī)制：DO11.10小鼠分為對(duì)照組、哮喘組、ICS組、rMS-Ag85a-IL-17a組及MS組。H&E染色計(jì)數(shù)BALF中細(xì)胞總數(shù)及分類計(jì)數(shù)，ELISA法檢測(cè)BALF中IL-17A、IL-6、IL-23、CXCL-1、CXCL-2的表達(dá)水平；RT-PCR檢測(cè)肺組織中ENA-78、NAP-2、NE、T-bet、GATA-3、ROR-γt的mRNA表達(dá)情況；測(cè)定BALF及肺組織中MPO活性；H&E和PAS染色觀察小鼠肺組織病理

7、改變。
　　結(jié)果：（1）DO11.10哮喘小鼠BALF中以PMN增多為主，IL-17A、IL-6、CXCL-1、CXCL-2及肺組織中ENA-78、NAP-2、NE的mRNA表達(dá)升高，MPO活性增強(qiáng)。（2）rMS-Ag85a-IL-17a誘導(dǎo)產(chǎn)生的血清IL-17A自身抗體可長(zhǎng)期維持較高水平的滴度，純化后IL-17A自身抗體具備良好的完整性、穩(wěn)定性及高活性。（3）IL-17A自身抗體能通過(guò)拮抗IL-17A，減少IL-17A效應(yīng)細(xì)胞分

8、泌趨化因子從而抑制PMN的聚集。（4）rMS-Ag85a-IL-17a干預(yù)NEA小鼠，可明顯減少BALF中白細(xì)胞總數(shù)及PMN數(shù)量；降低BALF中IL-17A、IL-6、IL-23、CXCL-1、CXCL-2及肺組織中ENA-78、NAP-2、NE的mRNA表達(dá)，抑制MPO的活性，其中肺組織中NE的mRNA表達(dá)明顯低于ICS組；T-bet、GATA-3、ROR-γt的mRNA表達(dá)無(wú)明顯差異；肺組織病理顯示 rMS-Ag85a-IL-17a