嗜酸性粒細(xì)胞主要堿性蛋白在哮喘中的測(cè)定及臨床研究.pdf

1、研究背景 嗜酸粒細(xì)胞(EOS)浸潤引起的氣道慢性炎癥是哮喘發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，EOS通過釋放嗜酸性顆粒性蛋白導(dǎo)致哮喘特征性的病理改變和氣道高反應(yīng)性。EOS顆粒蛋白主要有：EOS陽離子蛋白(ECP)，EOS主要堿性蛋白(MBP)，EOS過氧化物酶(EPO)，以及EOS神經(jīng)毒素(EDN)。在這些蛋白中，MBP是一種毒性極強(qiáng)的分泌蛋白，將生理數(shù)量的MBP施加至腫瘤細(xì)胞、寄生蟲和桿菌科微生物都能導(dǎo)致直接的毒力殺傷。MBP是導(dǎo)致毒蕈堿M2受體

2、功能失調(diào)的主要原因，能加強(qiáng)支氣管哮喘發(fā)作中副交感神經(jīng)介導(dǎo)的強(qiáng)烈氣道收縮。MBP還能造成哮喘患者氣道上皮的損傷，并刺激組胺、IL-5、IL-8等炎性因子的大量釋放。因此，MBP是哮喘發(fā)病過程中關(guān)鍵的致病物質(zhì)。 研究目的 臨床上傳統(tǒng)的檢測(cè)手段如肺功能、血常規(guī)、血沉并不能準(zhǔn)確的反映哮喘時(shí)患者氣道炎癥的變化情況，如肺功能正常時(shí)，氣道炎癥未必得到了很好控制；血常規(guī)等檢查又缺乏診斷的特異性。因此，人們一直在尋找一種能特異性反映氣道炎

3、癥病變的檢測(cè)方法來取代目前的常規(guī)手段。已經(jīng)證明MBP在哮喘發(fā)病中起著重要作用，作為EOS釋放的顆粒蛋白，MBP是目前最有希望反映哮喘病情嚴(yán)重程度的指標(biāo)。所以在本研究中我們對(duì)不同病情的哮喘患者及正常人群外周血MBP的含量進(jìn)行了測(cè)定。期待通過對(duì)MBP含量的測(cè)定，建立一種經(jīng)濟(jì)、高效、方便的檢測(cè)方法對(duì)哮喘病人的病情進(jìn)行評(píng)估。 研究方法 一、ELISA法檢測(cè)外周血MBP含量 選取哮喘輕度患者34例，中、重度患者28例，正常

4、對(duì)照者32例，分成三組。將受試者的血清加入96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板中，4℃包被過夜。接著加入小鼠抗人主要堿性蛋白單克隆抗體，在室溫下放置2小時(shí)。在每孔中加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠抗體。在37℃放置1小時(shí)后，加入底物顯色10分鐘，應(yīng)用全自動(dòng)酶標(biāo)比色儀在450nm處測(cè)定光密度值，依據(jù)主要堿性蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線查得對(duì)應(yīng)蛋白濃度，即得到各標(biāo)本主要堿性蛋白含量。 二、RT-PCR及半定量分析MBPmRNA的表達(dá) 運(yùn)用RT-PCR法，對(duì)

5、40例哮喘患者(輕度患者15例，中度15例，重度10例)和20例正常對(duì)照者M(jìn)BPmRNA的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定。擴(kuò)增人MBP引物及內(nèi)參照β-actin引物均由上海鼎安生物科技公司設(shè)計(jì)并合成，其中β-actin作為內(nèi)參。RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄均按照詳細(xì)的操作指導(dǎo)進(jìn)行。所得產(chǎn)物，用2％瓊脂糖凝膠電泳，以β-actin為陽性對(duì)照，用UVItec凝膠分析儀將電泳圖掃描后進(jìn)行分析。以積分光密度IOD(目的帶)/IOD(β-actin)之比進(jìn)行半定量分析。

6、 三、MBP測(cè)定與臨床相關(guān)檢測(cè)的比較 所有受試者均抽取靜脈血，進(jìn)行血常規(guī)五分類檢查，按哮喘輕度組，中、重度組，正常組分類統(tǒng)計(jì)，與各組MBP含量進(jìn)行比較。肺通氣功能測(cè)定使用6200AutoboxDL型體積描記儀，按規(guī)定校準(zhǔn)后測(cè)定。按哮喘輕度組，中、重度組記錄FEV1占預(yù)計(jì)值百分比(FEV1％Pred)、PEF占預(yù)計(jì)值百分比(PEF％Pred)等肺功能檢測(cè)數(shù)據(jù)，比較不同組別肺功能的差異。再將肺功能指標(biāo)和MBP測(cè)定結(jié)果進(jìn)行相關(guān)分析

7、。 四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 運(yùn)用SPSS10.0軟件，各組結(jié)果以Mean±SD表示。兩樣本均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)；多組比較采用單向方差分析(One-WayANOVA)；各組間比較采用LSD或Dunnetts法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P≤0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 一、ELISA法檢測(cè)外周血MBP含量結(jié)果 1、選擇標(biāo)準(zhǔn)品與空白對(duì)照OD值相差較大的一抗和二抗工作濃度，比較得出一抗1∶2000，二抗1∶

8、1000較為合適。 2、應(yīng)用PBS液稀釋主要堿性蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為20、10、8、5、2.5、1.25、0.625、0ng/ml，相應(yīng)OD值為：1.342、0.639、0.541、0.329、0.152、0.137、0.076、0.062，得到主要堿性蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，主要堿性蛋白標(biāo)準(zhǔn)品濃度與OD值呈線性關(guān)系：y=15.46x-0.4145。 3、對(duì)照主要堿性蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，哮喘患者輕度組；中、重度組；正常組MBP的

9、含量有顯著性差異(F=411.501，P＜0.001)。哮喘中、重度組MBP含量最高，正常組含量最低。癥狀緩解前患者體內(nèi)MBP的含量(5.28±1.59ng/ml)遠(yuǎn)高于緩解后(2.81±0.99ng/ml)。 二、RT-PCR及半定量分析結(jié)果 哮喘組患者的MBPmRNA表達(dá)水平為0.37±0.11；正常組MBPmRNA表達(dá)水平為0.17±0.04；兩組MBPmRNA表達(dá)有顯著性差異(t=7.837，P＜0.001)。不

10、同病情程度比較，中度病情哮喘組MBPmRNA表達(dá)水平(0.42±0.05)和重度哮喘組(0.47±0.05)，遠(yuǎn)高于輕度哮喘組MBPmRNA表達(dá)水平(0.25±0.06，P＜0.01)。 三、與臨床相關(guān)指標(biāo)研究結(jié)果 各組外周血嗜酸粒細(xì)胞數(shù)量和百分比存在顯著性差異，正常組最低，中重度哮喘組最高，與外周血MBP含量的趨勢(shì)一致。輕度組和哮喘重度組的肺功能主要指標(biāo)FEV1％Pred、PEF％Pred具有顯著性差異(P＜0.01)

11、。外周血MBP的含量同肺功能水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.8730，P＜0.001)結(jié)論 一、通過ELISA法研究，MBP被證實(shí)是一種非常重要的氣道活性物質(zhì)，與正常對(duì)照組相比，哮喘組外周血MBP含量顯著增高。 二、RT-PCR及半定量分析顯示，當(dāng)哮喘發(fā)作時(shí)，MBP表達(dá)基因被激活，MBPmRNA大量表達(dá)；不同哮喘病情組中，MBPmRNA的表達(dá)水平不同。 三、哮喘患者外周血嗜酸粒細(xì)胞數(shù)量和百分比的增加趨勢(shì)與MBP含量的增加