三疣梭子蟹鹽度相關基因表達分析及關聯(lián)SNP的開發(fā).pdf

1、三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)，俗稱梭子蟹，隸屬于甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)、梭子蟹科(Portunidae)、梭子蟹屬(Portunus)，是中國沿海的重要經(jīng)濟蟹類，主要分布于中國、馬來西亞群島、日本和朝鮮等海域。其可以存活于鹽度為13.7-47.7的水環(huán)境中，屬典型廣鹽性蟹類。在三疣梭子蟹的育苗過程中，鹽度微小的變化都可能導致變態(tài)的推遲、活力變差，乃至病害的發(fā)生。在三疣梭

2、子蟹養(yǎng)成過程中鹽度也起到了重要作用，對其存活、攝餌和生長均具有重要影響。然而，在三疣梭子蟹養(yǎng)殖過程中，降雨會改變水體的鹽度，因此養(yǎng)殖過程中產(chǎn)生鹽度脅迫是不可避免的。目前關于鹽度在三疣梭子蟹中的研究主要集中在酶活、免疫、蛻皮和能量收支等方面，而滲透壓調節(jié)分子機理的研究則相對較少。因此，從分子水平研究三疣梭子蟹的滲透壓調節(jié)機制顯得尤為重要。
　　采用RACE技術克隆獲得總長為1712 bp的三疣梭子蟹水通道蛋白基因全長cDNA序列，命

3、名為PtAQP基因。該基因5’和3’非編碼區(qū)分別為153 bp和788 bp，開放閱讀框為771 bp，推測編碼256個氨基酸，預測分子量為27.0 kD，理論等電點為8.26。生物信息學分析表明，PtAQP基因含有6個跨膜區(qū)和2個NPA單元，具有與MIP家族匹配的保守氨基酸序列，屬于穩(wěn)定蛋白；同源性和系統(tǒng)進化分析表明，三疣梭子蟹PtAQP氨基酸序列與可口美青蟹(Callinectes sapidus) AQP1的同源性最高(87％)，

4、與可口美青蟹緊密聚為一支；熒光定量RT-PCR分析表明，PtAQP基因在各組織中均有表達，而在胃中的相對表達量最高。通過分析PtAQP基因在鹽度脅迫中的表達規(guī)律發(fā)現(xiàn)，鹽度脅迫可顯著改變PtAQP基因在鰓和肝胰腺中的表達模式，整體呈先下降后上升最后下降到初始水平的表達趨勢。該研究結果表明PtAQP基因在三疣梭子蟹滲透壓調節(jié)中發(fā)揮重要作用。
　　本研究克隆了三疣梭子蟹胞內(nèi)氯離子通道蛋白基因，命名為PtCLIC。該基因cDNA全長200

5、0bp，5’和3’非編碼區(qū)(UTR)長分別為76 bp和1162 bp，開放閱讀框長762 bp，推測編碼253個氨基酸，預測分子量為29.2 kD，理論等電點為5.93。生物信息學分析表明，PtCLIC基因中未發(fā)現(xiàn)跨膜結構域，屬于不穩(wěn)定蛋白；同源性分析表明，PtCLIC基因編碼的氨基酸序列與蚤狀溞(Daphnia pulex) CLIC基因的同源性高達83%；系統(tǒng)進化分析表明，三疣梭子蟹與擬穴青蟹首先聚為一支；實時熒光定量RT-PCR

6、分析表明，PtCLIC基因在選取的所有組織中均有表達，在肝胰腺中的相對表達量最高，且顯著高于其他組織(P<0.05)。低鹽度脅迫顯著改變了PtCLIC基因在三疣梭子蟹鰓和肝胰腺中的表達模式，整體呈先上調后下調的趨勢，并發(fā)現(xiàn)該基因在低鹽耐受和低鹽敏感家系中的表達規(guī)律差異顯著。研究結果表明PtCLIC基因在三疣梭子蟹滲透壓調節(jié)中發(fā)揮重要作用，可輔助三疣梭子蟹耐低鹽品系的選育。
　　本研究采用RACE技術克隆三疣梭子蟹鈣網(wǎng)蛋白基因，命名

7、為PtCRT。該基因cDNA全長1676 bp，開放閱讀框1218 bp，共編碼405個氨基酸，預測分子量為46.74 kD，理論等電點為4.33，屬穩(wěn)定蛋白。生物信息學分析表明，PtCRT有一個17個氨基酸組成的信號肽序列，兩個保守的CRT家族標簽，一個CRT家族重復標簽和一個內(nèi)質網(wǎng)滯留信號四肽序列HDEL；同源性分析表明PtCRT基因與中國對蝦的CRT氨基酸序列同源性最高；實時定量RT-PCR分析表明PtCRT基因主要在鰓、肝胰腺和