三疣梭子蟹Toll樣受體基因的克隆及表達(dá)分析.pdf

1、目前，各種病害的頻發(fā)已經(jīng)成為制約我國(guó)三疣梭子蟹養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的重要因素。因此，對(duì)三疣梭子蟹免疫系統(tǒng)的研究將有助于在疾病的防治、預(yù)防、品種選育及三疣梭子蟹免疫抗病機(jī)理等領(lǐng)域的研究和闡明具有重要意義和價(jià)值。
　　Toll樣受體是一種重要的模式識(shí)別受體，在脊椎動(dòng)物以及無脊椎動(dòng)物先天性抗感染免疫中發(fā)揮重要作用。本研究采用同源克隆和RACE技術(shù)首次從三疣梭子蟹鰓組織中獲得 Pt-Toll的cDNA全長(zhǎng)，并利用半定量及實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)

2、 Pt-Toll在各組織中的分布及表達(dá)水平進(jìn)行了分析；同時(shí)在不同溫度(18℃、30℃)、鹽度(16‰、32‰)條件下，以及在溶藻弧菌、假絲酵母菌、WSSV和LPS的免疫刺激下，利用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR方法檢測(cè) Pt-Toll在三疣梭子蟹鰓組織和血淋巴中 mRNA水平的表達(dá)變化；體外構(gòu)建 Pt-Toll胞外結(jié)構(gòu)域序列原核表達(dá)載體 pEASY?-E1-Pt Toll，并在大腸桿菌 BL21(DE3)中表達(dá)該蛋白；利用大量原核表達(dá)的外源蛋白乳

3、化制備抗原，免疫注射小鼠并獲得抗血清，蛋白免疫印跡顯示所得到的抗血清能夠與抗原發(fā)生特異性結(jié)合。實(shí)驗(yàn)主要研究成果如下：
　　1.同源克隆和RACE技術(shù)獲得三疣梭子蟹 Toll樣受體基因 cDNA序列全長(zhǎng)，同源性分析表明，Pt-Toll與擬穴青蟹 SpToll、中華絨螯蟹 EsToll1的同源性最高，其次為凡納濱對(duì)蝦 LvToll2等蝦類，與黑腹果蠅 DmToll等物種的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。三疣梭子蟹 Toll樣受體具典型的TLR跨膜蛋

4、白結(jié)構(gòu)：富含13個(gè)亮氨酸重復(fù)序列的胞外區(qū)、跨膜區(qū)、含典型 TIR結(jié)構(gòu)域的胞內(nèi)區(qū)。
　　2.半定量和實(shí)時(shí)熒光定量 PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Pt-Toll基因在三疣梭子蟹的鰓、心臟、肌肉、血淋巴、腸道5個(gè)組織中都有表達(dá)，其中鰓組織中的表達(dá)量最高，步足肌和心臟中表達(dá)量相對(duì)較低。
　　3.實(shí)時(shí)熒光定量 PCR結(jié)果顯示，Pt-Toll在不同溫度(18℃、30℃)脅迫條件下鰓組織中的表達(dá)水平無顯著差異；在不同鹽度(16‰、32‰)脅迫條件下鰓組

5、織中 Pt-Toll的相對(duì)表達(dá)水平也無顯著性差異，說明三疣梭子蟹 Pt-Toll對(duì)溫度和鹽度的脅迫刺激不敏感。
　　4.實(shí)時(shí)熒光定量 PCR結(jié)果顯示，Pt-Toll在溶藻弧菌、假絲酵母菌、WSSV和LPS的免疫刺激下，僅 WSSV試驗(yàn)組在鰓組織中的表達(dá)水平差異不明顯，其他各組在鰓組織和血淋巴中的表達(dá)水平均表現(xiàn)顯著或極顯著上調(diào)，推測(cè) Pt-Toll可能參與三疣梭子蟹抗感染免疫過程。
　　5.成功構(gòu)建 pEASY?-E1-Pt