三疣梭子蟹Halloween基因克隆及功能驗證.pdf

1、生物蛻皮過程受到蛻皮激素調控，Halloween基因編碼的蛋白酶在蛻皮激素合成通路中起重要作用。為了探究3個 Halloween基因：spo（CYP307a1）、dib（CYP302a1）、sad（CYP315a1）在三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）蛻皮調控中的作用，采用 RT-PCR和 cDNA末端快速擴增技術（RACE），首次在三疣梭子蟹中分別克隆得到 Pt-spo基因（NCBI登錄號：KM030021

2、）、Pt-dib基因（NCBI登錄號：KM596851）、Pt-sad基因（NCBI登錄號：KM880023）。運用實時熒光定量 PCR（qPCR）方法，分析3個 Halloween基因在三疣梭子蟹不同組織和蛻皮周期中表達差異；利用 RNA干擾技術（RNAi），分析3個 Halloween基因被沉默后下游基因表達及蛻皮激素濃度變化情況；采取眼柄切除處理（ESA），探究3個 Halloween基因與蛻皮抑制激素（MIH）之間的作用關系。<

3、br>　　本研究主要內容包括：⑴克隆得到3個 Halloween基因全長，其中 Pt-spo、Pt-dib、Pt-sad分別為2200bp、2105bp、3171bp，開放閱讀框分別編碼520、541、553個氨基酸。經多序列比對分析發(fā)現，Pt-Spo與多齒新米蝦（Neocaridina denticulate）相似性最高為62％，Pt-Dib與果蠅（Drosophila melanogaster）相似性最高為40%，；Pt-Sad與多

4、齒新米蝦（N. denticulate）相似性最高為53%。構建進化樹比對分析后發(fā)現，Halloween基因編碼氨基酸分類符合生物傳統(tǒng)親緣關系，其中 Pt-dib編碼的Dib與昆蟲的Dib聚為一大類，Pt-sad編碼的Sad與岡比亞按蚊（Anopheles gambiae）、埃及伊蚊（Aedes aegypti）、果蠅（Drosophila melanogaster）等其它物種 Sad位于同一進化分支中。Dib家族能夠與 Sad家族、S

5、hd家族匯集在一個更大的分支，構成了細胞色素線粒體家族。Pt-spo編碼的Spo與昆蟲的Spo都聚集在 Spo家族分支中，與Phm家族共同匯集到細胞色素第2家族中。⑵qPCR結果顯示：3個基因均在 Y器中表達量最高，與其它各組織具有顯著性差異，這表明 Halloween基因功能比較單一，與 Y器是甲殼動物合成蛻皮激素主要器官結論一致。對 Halloween基因在三疣梭子蟹蛻皮周期分析發(fā)現，Pt-spo表達量在 C期最高，Pt-dib在

6、D1亞期最高，Pt-sad在 D1、D2亞期表達量達到峰值。3個 Halloween基因表達量高峰依次先后出現，與其處于蛻皮激素合成通路位置順序相一致，且表達量最高峰都早于蛻皮激素濃度峰值，可以推斷三疣梭子蟹3個Halloween基因在蛻皮調控中起重要作用。⑶RNAi實驗結果顯示：注射 ds-spo后，Pt-spo、Pt-dib、Pt-sad表達量均出現下調;注射 ds-dib后，Pt-spo表達量無顯著變化，Pt-dib和 Pt-sa

7、d均出現下調；在注射 ds-sad后，Pt-sad基因表達量顯著下調，Pt-spo和 Pt-sad則無顯著變化。對分別注射3個 Halloween基因 dsRNA的三疣梭子蟹抽取血淋巴，測定蛻皮激素濃度發(fā)現，spo組沒有顯著性變化，dib和 sad組與對照組相比顯著降低。表明3個Halloween基因在蛻皮激素合成的調控中可能存在級聯(lián)關系。⑷眼柄切除（ESA）實驗結果顯示：Pt-dib和 Pt-sad表達量均出現不同程度上升。其中 Pt