和厚樸酚抗胰腺癌作用及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景： 胰腺癌是一種惡性程度很高的消化系統(tǒng)腫瘤，但用嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)，目前胰腺癌化療的最高反應(yīng)率僅為20％。所以尋找新型抗胰腺癌藥物成為基礎(chǔ)和臨床研究的重點(diǎn)。第一部分和厚樸酚對(duì)人胰腺癌PANC-1細(xì)胞增殖和凋亡的影響研究 目的： 明確和厚樸酚能否在體外抑制入胰腺癌PANC-1細(xì)胞的生長(zhǎng)，研究和厚樸酚對(duì)PANC-1細(xì)胞細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響。 研究方法： 1、MTT法檢測(cè)和厚樸酚對(duì)PANC-1細(xì)胞

2、生長(zhǎng)的作用。 2、流式細(xì)胞儀檢測(cè)和厚樸酚對(duì)PANC-1細(xì)胞細(xì)胞周期的影響。 3、流式細(xì)胞儀檢測(cè)和厚樸酚對(duì)PANC-1細(xì)胞凋亡發(fā)生率的影響。 研究結(jié)果： 1、和厚樸酚對(duì)PANC-1細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用MTT法檢測(cè)和厚樸酚對(duì)PANC-1細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。 2、和厚樸酚對(duì)PANC-1細(xì)胞周期的影響10μg/ml、20μg/ml和40μg/ml和厚樸酚處理PANC-1細(xì)胞24h以后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的

3、變化情況。 3、和厚樸酚對(duì)PANC-1細(xì)胞凋亡的影響分別將10μg/ml、20μg/ml和40μg/ml和厚樸酚作用于PANC-1細(xì)胞，并設(shè)對(duì)照組，24h以后流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。 結(jié)論： 和厚樸酚對(duì)胰腺癌PANC-1細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯抑制作用，細(xì)胞凋亡和細(xì)胞G1期阻滯是其主要機(jī)制。 第二部分和厚樸酚的體外抗胰腺癌轉(zhuǎn)移活性的研究研究 目的： 研究和厚樸酚對(duì)胰腺癌PANC-1細(xì)胞體外粘附、遷

4、移、侵襲的影響。 研究方法： 1、細(xì)胞-基質(zhì)粘附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)和厚樸酚對(duì)PANC-1細(xì)胞遷移能力的影響。 2、劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)和厚樸酚對(duì)PANC-1細(xì)胞遷移能力的影響。 3、Transwell小室重建基底膜侵襲實(shí)驗(yàn)分析和厚樸酚對(duì)PANC-1細(xì)胞侵襲能力的影響。 研究結(jié)果： 1、和厚樸酚對(duì)PANC-1細(xì)胞體外粘附的影響經(jīng)和厚樸酚(10、20、40μg/ml)作用24h后，PANC-1細(xì)胞與纖維連接蛋白

5、(Fibronection，F(xiàn)n)的粘附作用減弱了，其效應(yīng)呈濃度依賴性。和厚樸酚10、20和40μg/ml劑量下腫瘤細(xì)胞粘附抑制率分別為20.01％±1.56％，42.78％±3.89％，65.34％±2.67％。 2、和厚樸酚對(duì)PANC-1細(xì)胞體外遷移的影響劃痕實(shí)驗(yàn)表明經(jīng)和厚樸酚(10、20、40μg/ml)作用24h后，PANC-1細(xì)胞的遷移能力逐漸降低，呈顯著的濃度依賴性。 3、和厚樸酚對(duì)PANC-1細(xì)胞體外侵襲的

6、影響Transwell小室重建基底膜侵襲實(shí)驗(yàn)表明：和厚樸酚與PANC-1細(xì)胞作用24h后，細(xì)胞穿越基底膜的能力顯著低于對(duì)照組，細(xì)胞侵襲數(shù)與藥物濃度成反比。和厚樸酚10、20和40μg/ml劑量下PANC-1細(xì)胞侵襲百分比分別為76.34％、52.72％、26.54％。 結(jié)論： 和厚樸酚可顯著抑制PANC-1細(xì)胞的粘附、遷移和侵襲能力。 第三部分和厚樸酚體外抗胰腺癌的機(jī)制研究研究 目的： 研究和厚樸

7、酚誘導(dǎo)PANC-1細(xì)胞凋亡、細(xì)胞G1期阻滯和抑制體外侵襲能力的分子機(jī)制。 研究方法： 1、Western blot法檢測(cè)和厚樸酚對(duì)caspase-8、procaspase-9、細(xì)胞色素C、procaspase-3和PARP蛋白表達(dá)的影響。 2、Western blot法檢測(cè)和厚樸酚對(duì)Bcl-XL、Bcl-2、Bad和Bax蛋白表達(dá)的影響。 3、Western blot法檢測(cè)和厚樸酚對(duì)Cyclin D1和C

8、DK4蛋白表達(dá)的影響。 4、Western blot法檢測(cè)和厚樸酚對(duì)MMP9蛋白表達(dá)的影響。 5、Western blot法檢測(cè)和厚樸酚對(duì)MAPK及PI3K/Akt通路的影響。 6、MTT法檢測(cè)p38MAPK通路抑制劑(SB 203580)和ERK通路抑制劑(PD98059)對(duì)和厚樸酚抑制PACN-1細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。 7、Western blot法檢測(cè)SB 203580和和厚樸酚共同作用后PANC-1細(xì)胞

9、cleaved-caspase-3、Cyclin D1和CDK4的表達(dá)。 研究結(jié)果： 1、和厚樸酚對(duì)caspase家族成員及細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)的影響Western bolt法表明：procaspase-9,procaspase-3在10、20和40μg/ml和厚樸酚處理24h后，其表達(dá)水平明顯下降，而caspase-8表達(dá)無明顯變化。另外，細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞漿明顯增加，PARP在處理組細(xì)胞被剪切，可見斷裂帶的產(chǎn)生。表明

10、和厚樸酚通過內(nèi)在凋亡途徑誘導(dǎo)PANC-1細(xì)胞凋亡。 2、和厚樸酚對(duì)Bcl-2家族成員蛋白表達(dá)的影響10、20和40μg/ml和厚樸酚處理使PANC-1細(xì)胞的Bcl-2和Bcl-XL蛋白表達(dá)水平顯著下降；Bad的表達(dá)增加；而Bax蛋白表達(dá)無明顯變化。 3、和厚樸酚對(duì)Cyclin D1和CDK4表達(dá)的影響和厚樸酚(10、20和40μg/ml)作用24h后，隨藥物濃度的增加，PANC-1細(xì)胞Cyclin D1和CDK4的表達(dá)逐

11、漸降低，呈顯著的濃度依賴性。 4、和厚樸酚對(duì)MMP9表達(dá)的影響和厚樸酚(10、20和40μg/ml)作用24h后，PANe-1細(xì)胞的MMP9表達(dá)逐漸降低，呈顯著的濃度依賴性。 5、和厚樸酚對(duì)MAPK和PI3K/AKT通路的影響40μg/ml和厚樸酚處理PANC-1細(xì)胞可活化p38MAP激酶，并且隨時(shí)間的延長(zhǎng)，其磷酸化水平更高，在0.5h時(shí)達(dá)高峰，且這一活性高峰維持到6h，同時(shí)和厚樸酚呈時(shí)間依賴性的減少了ERK的磷酸化水平

12、，但和厚樸酚對(duì)JNK通路和PI3K/Akt無明顯作用。這表明ERK和p38MAP信號(hào)通路可能在和厚樸酚抗胰腺癌中起一定作用。 6、p38MAPK通路抑制劑(SB 203580)和ERK通路抑制劑對(duì)和厚樸酚抑制PACN-1細(xì)胞生長(zhǎng)的影響MTT實(shí)驗(yàn)表明SB 203580可明顯逆轉(zhuǎn)和厚樸酚對(duì)PANC-1細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，而PD98059對(duì)和厚樸酚抑制PANC-1細(xì)胞生長(zhǎng)的作用沒有影響，和厚樸酚組(40μg/ml)、和厚樸酚(40μg

13、/ml)+SB203580(10μM)組及和厚樸酚(40μg/ml)+PD98059(25μM)的細(xì)胞存活率分別為31.02％±2.06％、83.64％±1.89％和35.78％±3.68％。 7、SB 203580與和厚樸酚共同作用對(duì)PANC-1細(xì)胞表達(dá)cleaved-caspase3、Cyclin D1和CDK4的影響40μg/ml和厚樸酚可使caspase3活化，出現(xiàn)剪切片段。而經(jīng)SB203580預(yù)處理后，和厚樸酚致cas

14、pase3活化的作用明顯被抑制。同時(shí)，也發(fā)現(xiàn)SB203580可逆轉(zhuǎn)和厚樸酚致Cyclin D1和CDK4表達(dá)下降的作用。 結(jié)論： 和厚樸酚通過活化p38MAPK通路導(dǎo)致細(xì)胞通過內(nèi)在途徑發(fā)生凋亡和細(xì)胞周期G1期阻滯。p38MAPK通路活化導(dǎo)致抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL表達(dá)減少，促凋亡蛋白Bad表達(dá)增加，致細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞漿增多、活化caspase9和caspase3，使PARP剪切。p38MAPK通路活化也可導(dǎo)

15、致Cyclin D1和CDK4表達(dá)下降從而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯。 第四部分和厚樸酚對(duì)PANC-1細(xì)胞裸鼠異種移植瘤作用的研究研究 目的： 研究和厚樸酚的體內(nèi)抗胰腺癌作用和機(jī)制。 研究方法： 1、建立PANC-1細(xì)胞裸鼠異種移植瘤模型，觀測(cè)和厚樸酚對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的作用。 2、HE染色檢查和厚樸酚對(duì)胰腺癌腫瘤病理學(xué)形態(tài)的影響。 3、免疫組化檢測(cè)和厚樸酚對(duì)VEGF表達(dá)的影響。 研究

16、結(jié)果： 1、和厚樸酚對(duì)PANC-1細(xì)胞裸鼠異種移植瘤作用和厚樸酚可明顯抑制PANC-1荷瘤鼠移植瘤在體內(nèi)的生長(zhǎng)，生理鹽水組、二甲基亞砜(DMSO)組和和厚樸酚組第30d時(shí)腫瘤的體積分別為：4.456±1.93cm3、4.765±1.67 cm3和2.641±1.03 cm3。生理鹽水組、DMSO組和和厚樸酚組第30d時(shí)腫瘤的重量分別為：2.354±0.634g、2.198±0.567g和1.095±0.302g,和厚樸酚的抑瘤率

17、達(dá)53.5％。 2、和厚樸酚對(duì)胰腺癌腫瘤病理學(xué)形態(tài)的影響取移植瘤常規(guī)組織病理切片鏡檢，鏡下移植瘤細(xì)胞形狀不規(guī)則，大小不一，核大，濃染，核異形性明顯，可見病理性核分裂相，核質(zhì)比例明顯增大。和厚樸酚組癌細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的退變，腫瘤中可見片狀及散在點(diǎn)狀壞死和凋亡。 3、和厚樸酚對(duì)移植瘤VEGF表達(dá)的影響VEGF主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞內(nèi)，VEGF的陽(yáng)性表達(dá)位于腫瘤細(xì)胞的胞漿和胞膜，部分血管內(nèi)皮細(xì)胞也可出呈陽(yáng)性表達(dá)。生理鹽水組和DMS