針灸對(duì)健康小鼠環(huán)磷酰胺所致骨髓抑制Notch信號(hào)通路影響的研究.pdf

1、目的:圍繞針灸改善健康小鼠化療后骨髓抑制、提升外周血白細(xì)胞這一主題，進(jìn)一步揭示針灸對(duì)化療后白細(xì)胞影響的變化規(guī)律；以Notch信號(hào)通路研究為切入點(diǎn)，利用生物芯片篩選CTX健康小鼠骨髓造血細(xì)胞中Notch信號(hào)網(wǎng)絡(luò)相關(guān)差異基因，應(yīng)用免疫組化法進(jìn)一步檢測(cè)差異基因的蛋白表達(dá)，從而進(jìn)一步篩選出針灸拮抗化療所致骨髓抑制作用中Notch信號(hào)通路上的重要信號(hào)分子，并運(yùn)用RT-PCR和Western-bolt方法檢測(cè)這些重要信號(hào)分子的mRNA的轉(zhuǎn)錄水平和蛋

2、白量，從分子生物學(xué)的層面探討針灸抗化療后骨髓抑制的作用機(jī)制，為針灸治療化療后骨髓造血功能障礙提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。
　　方法:選用雄性昆明種SPF級(jí)清潔小鼠40只，體重18±2 g，在實(shí)驗(yàn)室自由飼養(yǎng)3天后，稱量各小鼠體重后，運(yùn)用隨機(jī)分層分組的方法將小鼠隨機(jī)分到空白組(A組)、模型組(B組)、針刺組(C組)、艾灸組(D組)，每組10只。分組后用苦味酸溶液對(duì)各組小鼠先染色再進(jìn)行編號(hào)。檢查基礎(chǔ)白細(xì)胞計(jì)數(shù)后，將兩極小鼠刪除，每組僅保留8只用于實(shí)

3、驗(yàn)的小鼠。
　　依據(jù)《新藥(西藥)臨床前研究指導(dǎo)原則匯編》（中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥政局編）的造模方法，用環(huán)磷酰胺（CTX）建立骨髓抑制小鼠模型。按照100mg/kg/d用藥量腹腔注射，連續(xù)3天。依據(jù)環(huán)磷酰胺藥代動(dòng)力學(xué)過(guò)程，4小時(shí)后藥物活性消失，模型即成(中山醫(yī)學(xué)院等編著.基礎(chǔ)藥理學(xué).人民衛(wèi)生出版社，1979:442.)。
　　空白組小鼠按體重0.02ml/g的用藥量，注入注射用生理鹽水。模型復(fù)制成功后4小時(shí)，按照造模的順序進(jìn)

4、行治療?？瞻捉M、模型組只抓取、固定，不治療。針刺組將小鼠俯臥固定于自制木板上，選用華佗牌美容毫針(針具規(guī)格：0.19×10mm，針柄20mm)，采用管式進(jìn)針?lè)ǎ贝?，進(jìn)針深度為3mm，留針6min，每日1次，連續(xù)5天。艾灸組治療時(shí)將小鼠俯臥固定于自制小鼠固定板上，美容細(xì)艾條點(diǎn)燃后，(艾條規(guī)格：0.4×25cm)，在距離穴位皮膚2cm處固定懸灸，每穴3min，連續(xù)5天，每天治療1次。
　　治療后觀察針灸對(duì)白細(xì)胞的影響規(guī)律，并應(yīng)用基因

5、表達(dá)譜芯片對(duì)治療5天后的CTX健康小鼠的骨髓細(xì)胞進(jìn)行Notch信號(hào)通路相關(guān)差異基因的初步篩選，再應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)差異基因的蛋白表達(dá)，從而進(jìn)一步篩選出具有顯著差異的基因，然后對(duì)這些顯著性差異基因運(yùn)用RT-PCR和Western-bolt方法分別檢測(cè)其基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)量。通過(guò)觀察針灸后CTX健康小鼠Notch信號(hào)通路差異基因表達(dá)水平的變化，從骨髓細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路方面探討針灸改善化療后骨髓抑制、提升白細(xì)胞的作用機(jī)制。整個(gè)實(shí)驗(yàn)

6、過(guò)程嚴(yán)格遵守國(guó)家科技部發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》相關(guān)規(guī)定。
　　結(jié)果:1.“實(shí)驗(yàn)一”結(jié)果顯示:造模之前各組小鼠基礎(chǔ)白細(xì)胞計(jì)數(shù)無(wú)顯著差別(P>0.05)。造模成功后第2天、第3天小鼠外周血白細(xì)胞逐漸下降，與空白組比，其余各組小鼠的白細(xì)胞計(jì)數(shù)均降低，統(tǒng)計(jì)有顯著差異(P<0.05)；針刺組、艾灸組與模型組相比，白細(xì)胞計(jì)數(shù)無(wú)顯著性差異(P>0.05)。治療后第3天，針刺組與艾灸組均開(kāi)始回升，針刺組效果優(yōu)于艾灸組，且有顯著性差異

7、(P<0.05)；在第4~5天針刺組、艾灸組白細(xì)胞均明顯升高，第5天已達(dá)正常值。
　　2.“實(shí)驗(yàn)二”結(jié)果顯示:應(yīng)用基因芯片對(duì)各組小鼠骨髓造血細(xì)胞Notch信號(hào)通路相關(guān)差異基因進(jìn)行初步篩選，共篩選出7個(gè)差異基因：delta1、notch1、notch2、jag1、jag2、numb1、numb2。
　　3.“實(shí)驗(yàn)三”結(jié)果顯示:治療5天后，與空白組比，模型組中notch2和jag1、jag2上調(diào)，numb1和numb2下調(diào)，且具

8、有顯著性差異(P<0.05)；delta1、notch1無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比，針刺組與艾灸組中notch2和jag1、jag2下調(diào)，numb1和numb2上調(diào)，且具有顯著性差異(P<0.05)。與針刺組比，艾灸組中的jag2下調(diào)，具有顯著性差異(P<0.05)。在基因表達(dá)譜芯片篩選出的7個(gè)差異基因中又進(jìn)一步篩選出numb1、numb2、notch2、jag1這4個(gè)具有顯著性差異的基因。
　　4.“實(shí)驗(yàn)四”結(jié)果顯

9、示:健康小鼠注射CTX后，骨髓細(xì)胞Notch信號(hào)通路中顯著性差異基因jag1、notch2、numb1、numb2中，與空白組比模型組numb1、numb2 mRNA表達(dá)降低，且具有顯著性差異(P<0.05)，jag1、notch2 mRNA表達(dá)升高但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，經(jīng)過(guò)治療后雖然與模型組比較針刺組、艾灸組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但針刺、艾灸后numb1、numb2 mRNA表達(dá)均上調(diào)，jag1、notch2 mRNA表達(dá)均下調(diào)，

10、且艾灸組優(yōu)于針刺組，但無(wú)顯著性差異(P>0.05)。
　　5.“實(shí)驗(yàn)五”結(jié)果顯示:健康小鼠注射CTX后，jag1、notch2蛋白含量升高，numb1、numb2蛋白含量下降，說(shuō)明 CTX可引起健康小鼠骨髓細(xì)胞中的numb蛋白(numb1、numb2)含量下降，導(dǎo)致notch蛋白(jag1、notch2)含量增加。針灸治療5天后，針刺組、艾灸組與模型組比，jag1、notch2蛋白含量下降，且具有顯著性差異(P<0.05)；針刺組

11、、艾灸組與模型組比，numb2含量增加，且艾灸組具有顯著性差異(P<0.05)，針刺組、艾灸組與模型組比，numb1蛋白量變化雖無(wú)顯著性差異(P>0.05)，但有升高趨勢(shì)，且針刺組較艾灸組高。提示針灸可以通過(guò)增加numb蛋白的含量、降低notch蛋白含量。
　　結(jié)論:
　　1.針灸具有減輕CTX健康小鼠骨髓抑制，提升白細(xì)胞的作用，且白細(xì)胞的變化與導(dǎo)師組多年總結(jié)的變化規(guī)律相一致：即在治療第3天開(kāi)始回升，在第5天達(dá)到正常值，針刺

12、與艾灸兩種方法比較無(wú)顯著差異。
　　2.通過(guò)基因表達(dá)譜芯片和免疫組化的篩選，在各組健康小鼠骨髓造血細(xì)胞Notch信號(hào)通路上，共篩選出numb1、numb2、notch1、notch2、jag1、jag2、delta1等7個(gè)差異基因，其中numb1、numb2、notch2、jag1具有顯著性差異。
　　3.針刺、艾灸可以上調(diào)numb1、numb2 mRNA的表達(dá)，下調(diào)notch2、jag1 mRNA表達(dá)，可以促進(jìn)numb1、

13、numb2蛋白含量的增加，降低notch2、jag1蛋白含量。
　　4.針灸減輕 CTX化療引起的骨髓抑制，其可能的作用機(jī)制是：針灸能夠通過(guò)上調(diào)骨髓組織中Numb的含量，下調(diào)notch2、jag1含量，抑制過(guò)度激活的Notch信號(hào)通路，使骨髓造血干/祖細(xì)胞細(xì)胞增殖作用增強(qiáng)，分化細(xì)胞減少，從而造血干/祖細(xì)胞的數(shù)量得以增加，增強(qiáng)骨髓造血功能。
　　5.通過(guò)numb-Notch信號(hào)途徑的調(diào)節(jié),可能是Notch信號(hào)通路起到抗骨髓抑制