低劑量環(huán)磷酰胺對小鼠脾臟Treg細(xì)胞影響及聯(lián)合CIK細(xì)胞治療小鼠肝癌的研究.pdf

1、目的：通過研究單次和循環(huán)應(yīng)用環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)對荷瘤小鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells。Tregs)的影響及聯(lián)合細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine induced killer cells,CIKs)抗腫瘤的療效，初步探討環(huán)磷酰胺增強過繼性細(xì)胞免疫治療（adoptive cellular immunotherapy,ACI）腫瘤的機(jī)制，為提高ACI抗腫瘤療效提供思路。
　

2、　方法：體內(nèi)動物實驗以C57BL/6小鼠為研究對象，培養(yǎng)Hepa1-6小鼠肝癌細(xì)胞，注射于小鼠右側(cè)腋下建立小鼠肝癌皮下模型。觀察CTX對脾臟Tregs影響的實驗中將造模成功的小鼠隨機(jī)分為4組，每組40只小鼠，分別為正常小鼠組，單純荷瘤小鼠組，單次應(yīng)用CTX組，循環(huán)應(yīng)用CTX組。每組分別用相應(yīng)治療方案干預(yù)后獲取小鼠脾臟單細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+CD25+FoxP3+/CD4+T細(xì)胞比例，隔天測量小鼠腫瘤長短徑，計算腫瘤體積并繪制腫

3、瘤生長曲線。體外培養(yǎng)CIKs實驗將小鼠脾臟制成單細(xì)胞懸液，密度梯度離心法獲得脾臟單個核細(xì)胞做為培養(yǎng)CIKs的前體細(xì)胞，在體外經(jīng)干擾素-γ（interferon-γ。IFN-γ）、抗CD3e單克隆抗體(Anti CD3e monoclonal antibodies,anti-CD3Mab)、白介素-2（interlukin-2,IL-2）刺激，培養(yǎng)過程中繪制細(xì)胞增殖曲線，培養(yǎng)結(jié)束時用流式細(xì)胞術(shù)檢測CIKs中的主要效應(yīng)細(xì)胞表型CD8+NK1

4、.1+的含量，CCK-8法檢測CIKs對Hepa1-6肝癌細(xì)胞的殺傷活性。CTX聯(lián)合CIKs治療小鼠肝癌的實驗中，將造模成功的荷瘤小鼠隨機(jī)分為6組，每組5只，分別為單純荷瘤組，單次CTX治療組，循環(huán)CTX治療組，單純CIKs治療組，單次CTX+CIKs治療組，循環(huán)CTX+CIKs治療組，每組分別用相應(yīng)治療方案干預(yù)后，隔天測量小鼠腫瘤長短徑，計算腫瘤體積并繪制腫瘤生長曲線，實驗結(jié)束時，剝離瘤塊稱重，計算抑瘤率。
　　結(jié)果：在CTX對

5、脾臟Tregs影響實驗，未經(jīng)CTX治療組的荷瘤小鼠脾臟Tregs比例隨時間延長逐漸增加；單次CTX治療組Tregs比例出現(xiàn)短暫的降低，隨后恢復(fù)到初始水平并持續(xù)升高；循環(huán)CTX組Tregs維持在較低水平。實驗結(jié)束未經(jīng)治療的荷瘤小鼠、單次CTX、循環(huán)CTX治療組小鼠腫瘤體積分別為4056.5±865.4 mm3、3517.9±756.5 mm3、2256.4±620.3 mm3，單次CTX組與單獨荷瘤組腫瘤體積比較無差異（P＞0.05），循

6、環(huán)CTX組體積明顯小于單獨荷瘤組（P＜0.01）。體外培養(yǎng)CIKs實驗中，經(jīng)2周的培養(yǎng)，細(xì)胞總量增加14.4倍；CD8+NK1.1+雙陽性細(xì)胞的比例有由最初的0.7±0.3％增加到17.7±2.3%；在對Hepa1-6細(xì)胞的殺傷活性，效靶比為10:1、20:1、40:1時殺傷活性分別為25.99±3.53%、38.26±3.65%、54.77±5.35%。在CTX聯(lián)合CIKs治療小鼠肝癌實驗，實驗結(jié)束時單次CTX治療組腫瘤體積與荷瘤對照

7、組腫瘤體積無明顯差異（3764.8±537.7 vs3800.4±605.5 mm3，P=0.784）；單獨CIKs小于荷瘤對照組（3352.2±485.4 vs3800.4±605.5 mm3，P=0.02）；循環(huán)CTX明顯小于單次CTX組（2076.6±620.2 vs3764.8±537.7 mm3，P＜0.001）；單次CTX+CIKs組明顯小于單次CTX組（1867.1±533.6 vs3764.8±537.7 mm3，P＜0

8、.001），還小于單獨CIKs組（1867.1±533.6 vs3352.2±485.4 mm3。P＜0.001）；循環(huán)CTX+CIKs組明顯小于循環(huán)CTX（970.7±135.3 vs2076.6±620.2 mm3，P＜0.001）、單獨CIKs組（970.7±135.3 vs3352.2±485.4 mm3，P＜0.001），還小于單獨CTX+CIKs組（970.7±135.3 vs1867.1±533.6 mm3，P＜0.001

9、）。后期單獨CTX或單獨CIKs治療組腫瘤體積迅速增加，而CTX和CIKs聯(lián)合治療組腫瘤體積保持平緩上升趨勢。實驗結(jié)束單次CTX治療組，單獨CIKs治療組，循環(huán)CTX治療組，單次CTX+CIKs治療組，循環(huán)CTX+CIKs治療組5組抑瘤率分別為3.7%、5.2%、48.1%、54.4%、78.6%。
　　結(jié)論：隨著腫瘤發(fā)展，小鼠脾臟中Tregs比例逐漸增加；循環(huán)應(yīng)用CTX能夠使Tregs在較長時間內(nèi)維持在相對較低水平，一定程度上抑