甲氨蝶呤聯(lián)合環(huán)磷酰胺對(duì)OVA致敏小鼠樹(shù)突狀細(xì)胞調(diào)控Th17-Treg免疫平衡作用的研究.pdf

1、背景
　　樹(shù)突狀細(xì)胞（Dendriticcells,DCs）對(duì)輔助性T細(xì)胞17（Thelpcell17,Th17）/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（RegulatoryTcell,Treg）平衡的調(diào)控是免疫學(xué)研究中目前最為活躍的研究領(lǐng)域之一。Treg和新近發(fā)現(xiàn)的Th17是機(jī)體存在的兩種不同于Th1和Th2的CD4+T細(xì)胞新亞型。Thl7細(xì)胞介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，Treg細(xì)胞維持免疫耐受，機(jī)體處于正常狀態(tài)下二者保持平衡。新近研究發(fā)現(xiàn)，在諸如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rh

2、eumatoidarthritis,RA）、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemiclupuserythematosus,SLE）等自身免疫性疾病中存在Th17/Treg細(xì)胞失衡，進(jìn)而誘導(dǎo)異常免疫應(yīng)答[1]。位于免疫調(diào)節(jié)上游的機(jī)體最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞——樹(shù)突狀細(xì)胞（Dendriticcells,DCs）對(duì)于上述免疫平衡起到了關(guān)鍵的調(diào)控作用[2]。改變病情抗風(fēng)濕藥（diseasemodifyinganti-rheumaticdrugs,DMARDs

3、）的聯(lián)合使用是治療自身免疫性疾病的重要策略。甲氨蝶呤（Methotrexate,MTX）等DMARDs藥物對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞調(diào)控Th17/Treg免疫平衡的影響國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。通過(guò)10余年的臨床與基礎(chǔ)研究，我們已證實(shí)周期特異性藥物MTX與周期非特異性藥物環(huán)磷酰胺（Cyclophosphamide,CTX）聯(lián)合治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎具有協(xié)同效應(yīng)。鑒于此，本課題從樹(shù)突狀細(xì)胞的角度進(jìn)行協(xié)同機(jī)制的研究，探討MTX聯(lián)合CTX是否通過(guò)影響DC功能，最終重建T

4、h17/Treg免疫平衡。
　　目的
　　1.研究單用MTX、單用CTX以及MTX聯(lián)合CTX對(duì)DC成熟度的影響；
　　2.研究各組DC成熟度與DC刺激T細(xì)胞增殖能力的相關(guān)性；
　　3.初步探討MTX聯(lián)合CTX作用下，DC對(duì)Th17/Treg細(xì)胞平衡調(diào)控作用的影響。
　　方法
　　建立雄性C57小鼠的卵清蛋白（ovalbumin,OVA）致敏模型，隨機(jī)分為OVA模型對(duì)照組、MTX組（3.03mg.kg-

5、1.w-1）、CTX組（80.88mg.kg-1.3w-1）及MTX聯(lián)合CTX組（MTX3.03mg.kg-1.w-1，CTX80.88mg.kg-1.3w-1）。OVA免疫后2d開(kāi)始給藥，共9周，于0、3、6、9周4個(gè)時(shí)點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采集各組小鼠骨髓，誘導(dǎo)培養(yǎng)DC，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組DC表面分子（CD40、CD80、CD86、MHC-Ⅱ）的表達(dá)；各組DC與同種異體正常小鼠CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)，3H-TdR檢測(cè)T細(xì)胞增殖；進(jìn)一步分析MTX

6、聯(lián)合CTX作用下的DC與Th17/Treg細(xì)胞水平的相關(guān)性。
　　結(jié)果
　　1.給藥前，檢測(cè)空白對(duì)照組與OVA組DC表面分子（CD40、CD80、CD86、MHC-Ⅱ）的表達(dá)，后者表達(dá)升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；
　　2.隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，DC表面分子（CD40、CD80、CD86、MHC-Ⅱ）的表達(dá)在各給藥組中均呈下降趨勢(shì)（P<0.05）；
　　3.MTX聯(lián)合CTX治療組表面分子的表達(dá)下降最明顯

7、。第9周，聯(lián)合組與OVA組及單藥組比較，表面分子表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），單藥組與OVA組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），單藥組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；
　　4.第9周各組DC與同種異體CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測(cè)T淋巴細(xì)胞增殖，結(jié)果顯示：與單純T細(xì)胞對(duì)照組比較，OVA組、MTX組及CTX組T細(xì)胞增殖升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），聯(lián)合組T細(xì)胞增殖無(wú)顯著差異（t=0.767,P=0.4

8、61）；與OVA模型對(duì)照組比較，各給藥組T細(xì)胞增殖均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；各給藥組間比較，聯(lián)合組較MTX或CTX單藥組增殖下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.998,P=0.012;t=2.703,P=0.035），單藥組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；
　　5.MTX聯(lián)合CTX組在0、3、6、9周各表面分子（CD40、CD80、CD86、MHC-Ⅱ）的表達(dá)與相對(duì)應(yīng)的Th17/Treg細(xì)胞比值呈正相關(guān)（分別為：r

9、=0.862，P<0.001；r=0.855，P<0.001；r=0.865，P<0.001；r=0.860，P<0.001）。
　　結(jié)論
　　1.DC成熟程度與DC刺激T細(xì)胞增殖的能力平行；
　　2.DC成熟程度升高，Th17炎性反應(yīng)活躍；相反，DC成熟程度降低，Treg免疫抑制增強(qiáng)。各用藥組均可抑制DC成熟，進(jìn)而Th17/Treg比值降低，MTX聯(lián)合CTX對(duì)其影響最為顯著；
　　3.MTX聯(lián)合CTX明顯抑制D