針灸治療UC模型小鼠的Th17-Treg免疫平衡機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　Th17/Treg免疫平衡紊亂是新近發(fā)現(xiàn)的與潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative colitis，UC）密切相關(guān)的重要病因。本研究以UC模型小鼠為載體，研究針灸對(duì)小鼠免疫功能的影響，并從Th17、Treg分泌的特征性細(xì)胞因子及其上游轉(zhuǎn)錄因子RORγ t和FOXp3入手，揭示針灸穩(wěn)定Th17/Treg免疫平衡進(jìn)而發(fā)揮治療UC效應(yīng)的生物學(xué)機(jī)制，以期為臨床應(yīng)用針灸治療UC的機(jī)理提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　

2、36只健康雄性體重36g±2g的昆明種小鼠采用3％葡聚糖硫酸鈉（DSS）法復(fù)制潰瘍性結(jié)腸炎模型。造模成功后再隨機(jī)分為模型組、電針組、艾灸組，每組12只，另設(shè)12只為空白對(duì)照組。電針組和艾灸組從造模第5d開始,選取關(guān)元、足三里連續(xù)治療5d，每次10min，空白組和模型組只捆綁不治療。觀察小鼠的一般情況、評(píng)價(jià)疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI），光鏡下觀察遠(yuǎn)端結(jié)腸病理形態(tài)結(jié)構(gòu)，透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)，明確針灸對(duì)UC的治療效應(yīng)；運(yùn)用酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢

3、測 IL-2血清含量，免疫組化結(jié)合Western Blot法檢測TLR2和TLR4受體及蛋白在小鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸的表達(dá)，觀察針灸對(duì)UC小鼠免疫功能的影響；比較針灸對(duì)Th17/Treg免疫平衡軸相關(guān)的促炎因子IL-6、IL-17A、IL-17F和抗炎因子IL-10、TGF-β的血清含量及Th17、Treg上游轉(zhuǎn)錄因子RORγ t、FOXp3的表達(dá)，明確針灸是否具有調(diào)整Th17/Treg免疫平衡的作用，探討針灸治療UC的機(jī)制。
　　結(jié)果:<

4、br>　　1.針灸對(duì)UC小鼠的治療效應(yīng)研究
　?。?）造模后的UC小鼠一般狀況較差，毛發(fā)稀疏缺少光澤、糞便質(zhì)軟或稀，肉眼血便，DAI評(píng)分顯著增高；HE切片顯示，模型組結(jié)腸黏膜充血明顯，中至重度水腫，腺體結(jié)構(gòu)被破壞，杯狀細(xì)胞增多，有潰瘍面及壞死灶，大量炎細(xì)胞浸潤；透射電鏡顯示，模型組核內(nèi)染色質(zhì)分布不均勻，細(xì)胞內(nèi)空泡增多，胞漿內(nèi)線粒體腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，細(xì)胞核染色質(zhì)聚集，微絨毛稀疏，上皮細(xì)胞間隙明顯增寬。
　　（2）電針和艾灸

5、治療后：UC小鼠一般狀況明顯好轉(zhuǎn)，大便性狀、肉眼血便等情況明顯改善，DAI評(píng)分下降。治療組與模型組比較，DAI評(píng)分具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），治療組之間無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。HE切片顯示,電針組和艾灸組均接近空白組，表現(xiàn)為部分腺體破壞，黏膜下層輕度水腫，存在少量炎細(xì)胞浸潤；透射電鏡顯示，電針組及艾灸組胞漿內(nèi)線粒體輕度腫脹，細(xì)胞核染色少量聚集，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)稍微擴(kuò)張，微絨毛基本正常。
　　2.針灸對(duì)UC小鼠免疫調(diào)節(jié)的影響

6、研究
　　(1)造模后：模型組血清IL-2含量降低，與空白組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）；免疫組化切片顯示，空白組TLR2、TLR4受體無或僅有很少弱陽性表達(dá)，模型組陽性表達(dá)明顯，統(tǒng)計(jì)顯示，模型組遠(yuǎn)端結(jié)腸TLR2、TLR4受體表達(dá)明顯升高，與空白組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）；模型組遠(yuǎn)端結(jié)腸組織中TLR2、TLR4受體蛋白表達(dá)增強(qiáng)，與空白組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。
　?。?）電針和艾灸治療后：血清IL-2含

7、量升高，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）；免疫組化切片顯示，電針組和艾灸組TLR2、TLR4受體陽性表達(dá)比模型組明顯減少，統(tǒng)計(jì)顯示，電針和艾灸治療后遠(yuǎn)端結(jié)腸TLR2、TLR4受體表達(dá)明顯減弱，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），與電針比較，艾灸組降低TLR4受體表達(dá)趨勢更明顯且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；電針和艾灸治療后TLR2、TLR4蛋白表達(dá)比模型組明顯降低，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。灸法組與電針組比

8、較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。
　　3.針灸對(duì)UC小鼠Th17/Treg免疫平衡軸的調(diào)控研究
　　（1）造模后：模型組IL-6、IL-17A、IL-17F血清含量明顯升高，IL-10、TGF-β血清含量明顯降低，與空白組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）；模型組遠(yuǎn)端結(jié)腸RORγ t蛋白表達(dá)增強(qiáng)，F(xiàn)OXp3蛋白表達(dá)減少，與空白組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。
　?。?）電針和艾灸治療后：IL-6、IL-17A血清含量

9、明顯降低，IL-10、TGF-β血清含量明顯升高，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），治療組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。電針和艾灸對(duì)IL-17F有降低趨勢，但與模型組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；治療后RORγ t蛋白表達(dá)明顯降低、FOXp3蛋白表達(dá)增強(qiáng)，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），與電針組相比，灸法組對(duì)促進(jìn)FOXp3蛋白表達(dá)作用更明顯具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　（1）電針