DHV-Ⅰ對鴨巨噬細胞TLRs信號通路的影響.pdf

1、鴨病毒性肝炎(Duckviralhepatitis,DVH)是由鴨肝炎病毒(Duckhepatitisvirus,DHV)引起的鴨類傳染病,DHV分為DHV-Ⅰ型、DHV-Ⅱ型、DHv-Ⅲ型和新型DHV。DHV-Ⅰ型病毒入侵機體后能迅速復制,并能突破血腦屏障引起雛鴨急性死亡。研究表明,干擾素(Interferon,IFN)和白介素(Interleukin,IL)能抑制病毒在機體內(nèi)的復制,而Toll樣受體7(Toll-likerecept

2、or7,TLR7)通過識別病毒ssRNA激活依賴MyD88信號通路,活化免疫細胞而釋放Ⅰ型IFN、IL-6、IL-12等細胞因子,起到抵御病毒的入侵及復制作用。已有試驗表明,通過上調(diào)TLR7的表達可以抑制ssRNA病毒如丙型肝炎病毒(HepatitisCvirus,HCV)[1]、呼吸道合胞病毒(Respiratorysyncytialvirus,RSV)[2]及兩尼羅河病毒(Westnilevirus,WNV)[3]在機體內(nèi)的復制,但

3、目前尚未見有關(guān)于DHV-Ⅰ型病毒感染對TLRs信號通路影響的研究報道。
　　 本研究通過分析鴨TLR7、MyD88、NF-kB、IL-6和IFN-α基因在雛鴨體內(nèi)組織的分布情況,檢測在DVH-Ⅰ感染鴨巨噬細胞0h、2h、8h、24h和32h時,TLR7、MyD88、NF-kB、IL-6和IFN-αmRNA表達量,并用RNAi技術(shù)沉默鴨TLR7基因表達,擬探討DHV-I對TLRs信號通路的影響,了解機體對DHV-I的識別及所引起炎

4、癥反應的機制,為進一步通過調(diào)節(jié)TLRs信號通路來防治DHV-I感染提供理論和試驗依據(jù)。
　　 1.鴨TLR7、MyD88、NF-kB、IL-6和IFN-α基因組織表達及序列分析
　　 參照NCBI公布序列設計鴨TLR7、MyD88、NF-kB、IL-6和IFN-α的特異性引物,建立RT-PCR檢測TLR7、MyD88等5種免疫信號通路關(guān)鍵分子的mRNA在鴨心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦和法氏囊7個組織中的表達?；蚪M織

5、表達圖譜顯示,在鴨7個組織中均檢測到TLR7、NF-kB、IL-6和IFN-αmRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物;而MyD88在腎和腦組織中未見轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,但在其他組織中有表達。本試驗檢測到鴨TLR7、MyD88、NF-kB、IL-6和IFN-α基因主要分布于外周免疫器官,這可能是因這些基因參與機體免疫調(diào)節(jié)和炎癥過程。迄今,尚未見有鴨MyD88與NF-kB基因序列的報道,對本試驗克隆到的鴨MyD88和NF-kB部分基因進行測序并用BLAST比較相似性。結(jié)果

6、顯示,鴨MyD88、NF-kB基因序列與雞、珍珠鳥等禽鳥類的相似性在90%左右,與人、鼠的相似性在80%左右;對核酸序列推導氨基酸序列進行的同源性比較發(fā)現(xiàn),鴨MyD88、NF-kB與雞、珍珠鳥等禽鳥類同源性最高,均為97%～100%;而鴨MyD88與人、鼠的同源性均為84%,鴨NF-kB與人、鼠的同源性分別為36%、34%。這表明,不同物種間的MyD88部分基因具有保守性,而NF-kB部分基因的保守性不高。
　　 2.DVH-I

7、對鴨TLR7、MyD88、NF-kB、IL-6和IFN-αmRNA表達量影響
　　 通過CFXManager1.6軟件對本試驗建立的鴨TLR7、MyD88、NF-kB、IL-6和IFN-α引物建立其SYBRGreenI熒光定量RT-PCR檢測方法進行分析,得出本法中TLR7、MyD88、NF-kB、IL-6和IFN-α基因產(chǎn)物分別在80℃、85℃、83.5℃、91.5℃、82℃出現(xiàn)單特異性峰,基因擴增分別為102.2%、101.

8、9%、99.4%、105.1%、94.4%,相關(guān)系數(shù)分別為0.999、0.993、0.999、0.997、0.989,均符合建立熒光定量PCR方法的標準,說明本試驗所建立的檢測鴨TLR7、MyD88等基因的熒光定量RT-PCR的特異性高。用所建立的熒光定量RT-PCR方法檢測DHV-I感染鴨原代巨噬細胞2h、8h、24h和32h時的TLR7、MyD88、NF-kB、IL-6和IFN-αmRNA相對表達量,并用duncan法分析組問的差異

9、。結(jié)果顯示,鴨TLR7和NF-kBmRNA表達量在DHV-I感染細胞8h至24h間迅速升高;MyD88、IL-6和IFN-αmRNA表達量在感染2h至8h間無明顯變化,在感染24h時明顯升高,表明DHV-I能誘導鴨巨噬細胞上調(diào)TLR7的表達并增加IFN-α、IL-6的表達。TLR7、MyD88、NF-kB和IL-6mRNA表達量在感染32h時均顯著下調(diào),推測是由于TLR7表達量的成倍增加啟動細胞TLRs信號通路負調(diào)控機制,降低整體信號通

10、路分子基因表達。
　　 3.RNAi沉默TLR7對鴨巨噬細胞表達細胞因子的影響
　　 本試驗設計一對與靶基因無同源性的熒光標記陰性對照siRNA,在Lipofectamine2000介導下轉(zhuǎn)染鴨原代巨噬細胞,優(yōu)化RNAi實驗所需轉(zhuǎn)染試劑計量和siRNA濃度。發(fā)現(xiàn)采用Lipofectamine2000計量(1.0μl)與siRNA濃度(50pmol)能達到約75%的轉(zhuǎn)染效率。針對鴨TLR7基因設計并合成了3對siRNA(s

11、iRNA500、siRNA1681、siRNA2957)分別進行RNAi試驗,采用SYBRGreenI熒光定量RT-PCR檢測TLR7mRNA表達量,比較其抑制率,篩選能有效抑制TLR7表達的siRNA。結(jié)果表明:siRNA1681能有效沉默巨噬細胞內(nèi)鴨TLR7基因mRNA的表達,使TLR7mRNA表達量減少了約71%,符合siRNA轉(zhuǎn)染后應干擾70%mRNA表達水平的標準。采用siRNA1681沉默TLR7基因表達,檢測在DHV-I感