巨噬細(xì)胞Coronin-1不同表達(dá)水平對(duì)iNOS、TLRs表達(dá)以及凋亡的影響.pdf

1、目的：
　　研究巨噬細(xì)胞冠蛋白-1（Coronin-1）不同表達(dá)水平對(duì)iNOS、TLRs表達(dá)和凋亡的影響及其可能機(jī)制。
　　方法：
　　1.據(jù)Coronin-1表達(dá)水平的差異，將實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞分為RAW264.7-Cor.Plus（過表達(dá)）、RAW264.7（正常表達(dá)）和RAW264.7-Cor.Minus（抑制表達(dá)）三組。用Realtime PCR法檢測(cè)Coronin-1不同表達(dá)水平巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(induc

2、ible nitric oxide synthase,iNOS)mRNA水平；Western-blot法檢測(cè)細(xì)胞Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)，其中主要檢測(cè)TLR2、TLR4、TLR9的蛋白表達(dá)水平；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡百分率。
　　2.各組細(xì)胞經(jīng)4μmol/L的鈣調(diào)磷酸酶抑制劑環(huán)孢素A(cyclosporin A,CsA)處理24h，用Western-blot法檢測(cè)CsA處理前后Coro

3、nin-1不同表達(dá)水平巨噬細(xì)胞鈣調(diào)磷酸酶的蛋白質(zhì)表達(dá)。RAW264.7（正常表達(dá)）組細(xì)胞經(jīng)2μmol/L肌動(dòng)蛋白聚合抑制劑細(xì)胞松弛素D(cytochalasin D,cytD)處理48h后，用四甲基異硫氰酸熒光素標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽（TRITC-phalloidin）對(duì)細(xì)胞染色，計(jì)算Coronin-1不同表達(dá)水平巨噬細(xì)胞以及cytD處理前后RAW264.7細(xì)胞纖維型肌動(dòng)蛋白（F-actin）重排率。
　　3.各組細(xì)胞經(jīng)4μmol/L環(huán)孢

4、素A(CsA)和2μmol/L細(xì)胞松弛素D(cytD)分別處理24h和48h。用Realtime PCR法檢測(cè)iNOS mRNA水平；Western-blot法檢測(cè)細(xì)胞 TLR2、TLR4、TLR9的蛋白質(zhì)水平；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡百分率。
　　結(jié)果：
　　1.RAW264.7-Cor.Minus（抑制表達(dá)）組細(xì)胞，其iNOS、TLR2、TLR4、TLR9的表達(dá)以及細(xì)胞凋亡率與RAW264.7（正常表達(dá)）組細(xì)胞相比沒有顯著

5、差異（P＞0.05）。RAW264.7-Cor.Plus（過表達(dá)）組細(xì)胞與RAW264.7組細(xì)胞相比，iNOS、TLR2、TLR4、TLR9表達(dá)以及細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05）。各項(xiàng)指標(biāo)趨勢(shì)為：RAW264.7>RAW264.7-Cor.Plus（P＜0.05）。
　　2.巨噬細(xì)胞鈣調(diào)磷酸酶表達(dá)水平與Coronin-1不同表達(dá)水平呈正相關(guān)。RAW264.7-Cor.Plus（過表達(dá)）、RAW264.7（正常表達(dá)）和RAW26

6、4.7-Cor.Minus（抑制表達(dá)）三組細(xì)胞的鈣調(diào)磷酸酶表達(dá)水平依次降低。經(jīng)CsA處理后，RAW264.7和RAW264.7-Cor.Plus組細(xì)胞鈣調(diào)磷酸酶表達(dá)水平顯著低于未處理組（P＜0.05）。鈣調(diào)磷酸酶表達(dá)水平呈現(xiàn)趨勢(shì)：RAW264.7-Cor.Plus>RAW264.7>RAW264.7-Cor.Minus；RAW264.7>RAW264.7+CsA；RAW264.7-Cor.Plus>RAW264.7-Cor.Plus+C

7、sA（P＜0.05）。
　　經(jīng)TRITC-phalloidin染色后，各組細(xì)胞F-actin重排率從高至低依次為RAW264.7-Cor.Plus、RAW264.7、RAW264.7-Cor.Minus（P＜0.05）。cytD處理組細(xì)胞，其F-actin重排率顯著低于未處理組（P＜0.05）。
　　3.RAW264.7-Cor.Plus組細(xì)胞經(jīng)CsA處理后，其iNOS、TLR2、TLR4、TLR9表達(dá)以及細(xì)胞凋亡率顯著高于

8、未處理組（P＜0.05）。各項(xiàng)指標(biāo)趨勢(shì)為：RAW264.7-Cor.Plus+CsA>RAW264.7-Cor.Plus（P＜0.05）。cytD處理前后，RAW264.7-Cor.Plus組細(xì)胞iNOS mRNA表達(dá)和細(xì)胞凋亡率并無顯著差異，但 RAW264.7和 RAW264.7-Cor.Plus組細(xì)胞TLR2、TLR4、TLR9的表達(dá)都被顯著抑制，這種效應(yīng)與Coronin-1的表達(dá)水平無關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1.Cor

9、onin-1過表達(dá)抑制巨噬細(xì)胞iNOS、TLR2、TLR4、TLR9表達(dá)和細(xì)胞凋亡。
　　2.Coronin-1過表達(dá)可促進(jìn)巨噬細(xì)胞CaN蛋白表達(dá)和F-actin重排。CsA可抑制巨噬細(xì)胞CaN的表達(dá)；cytD對(duì)細(xì)胞F-actin重排具有顯著抑制效應(yīng)，但與Coronin-1表達(dá)水平無關(guān)。
　　3.Coronin-1可能通過激活鈣調(diào)磷酸酶信號(hào)通路，抑制巨噬細(xì)胞iNOS、TLRs表達(dá)和細(xì)胞凋亡，這一過程并不依賴于F-actin調(diào)