不同尿素氮水平尿毒癥患者血清對(duì)體外培養(yǎng)HUVEC表達(dá)NO、MDA、iNOS的影響.pdf

1、研究背景：國(guó)內(nèi)和國(guó)外眾多文獻(xiàn)報(bào)道心血管疾病(CVD)是終末期腎臟疾病(ESRD)患者最主要的死亡原因。ESRD患者CVD的患病率和死亡率是腎功能正常人群的10～20倍，占ESRD患者總死亡率的50％。其中動(dòng)脈粥樣硬化(AS)又是CVD的主要并發(fā)癥，隨著AS病變的進(jìn)展其CVD的死亡率增加。與尿毒癥AS有關(guān)的傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素如高血壓、脂質(zhì)代謝紊亂、糖尿病、吸煙等已不能完全解釋這一現(xiàn)象。AS是血管內(nèi)皮損傷后的一種緩慢而復(fù)雜的增生性疾病與血管內(nèi)皮細(xì)

2、胞之間關(guān)系密切。目前被普遍接受的ROSS修正的“損傷反應(yīng)”學(xué)說(shuō)認(rèn)為，內(nèi)皮細(xì)胞功能性損傷是AS形成早期的始動(dòng)環(huán)節(jié)。充分說(shuō)明了內(nèi)皮細(xì)胞功能異常在AS發(fā)生和進(jìn)展中起重要作用。多數(shù)學(xué)者證實(shí)尿毒癥患者普遍存在內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，是導(dǎo)致ESRD患者AS的關(guān)鍵因素。然而其確切機(jī)制至今未明。最近的證據(jù)認(rèn)為與尿毒癥有關(guān)的非傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素：尿毒癥毒素、氧化應(yīng)激、炎癥可能是加速ESRD患者內(nèi)皮細(xì)胞損傷導(dǎo)致其AS的原因。為了進(jìn)一步明確上述因素對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用，

3、我們利用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)體外培養(yǎng)模型，以血清尿素氮濃度作為衡量體內(nèi)毒素水平的指標(biāo)，觀察了不同尿素氮水平尿毒癥患者血清對(duì)HUVEC—氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)及誘導(dǎo)型—氧化氮合酶(iNOS)表達(dá)的影響。探討尿毒癥患者AS發(fā)病的可能機(jī)制。 目的：了解不同尿素氮水平尿毒癥患者血清對(duì)體外培養(yǎng)HUVEC表 達(dá)NO、MDA、及iNOS

4、的影響。探討尿毒癥患者AS發(fā)病的可能機(jī)制，為預(yù)防和治療尿毒癥患者的心血管并發(fā)癥提供一些理論依據(jù)。方法： 1．采集中南大學(xué)湘雅二院‘腎內(nèi)科符合入選標(biāo)準(zhǔn)的尿毒癥患者血清，按血清尿素氮水平分為五組，每組各5例患者，共20例；以該院同期符合入選標(biāo)準(zhǔn)的健康志愿者10例為正常血清對(duì)照組。 2．體外培養(yǎng)HUVEC，加入20％不同組的血清分別共同孵育6小時(shí)和24小時(shí)。本實(shí)驗(yàn)共分七組：空白對(duì)照組(單純培養(yǎng)液組0.1％FCS)；正常血清對(duì)照

5、組(正常人血清)；尿素對(duì)照組(50mmol／L尿素溶液)：尿毒癥血清I組(BUN20～30mmol／L的尿毒癥患者血清)：尿毒癥血清Ⅱ組(BUN30～40mmol／L的尿毒癥患者血清)；尿毒癥血清Ⅲ組(BUN40～50mmol／L的尿毒癥患者血清)；尿毒癥血清Ⅳ組(BUN≥50mmol／L的尿毒癥患者血清)。 3．比色法測(cè)定HUVEC培養(yǎng)上清液6小時(shí)、24小時(shí)NO、MDA的含量；免疫細(xì)胞化學(xué)法測(cè)定24h后胞漿的iNOS表達(dá)；酶聯(lián)

6、免疫吸附法(ELISA)測(cè)定24h后培養(yǎng)上清液iNOS的蛋白水平。結(jié)果： 1．HUVEC培養(yǎng)上清液NO檢測(cè)的結(jié)果。 (1)培養(yǎng)第6h結(jié)果：尿毒癥血清各組與對(duì)照組比較N0有明顯降低(P<0.01)；尿毒癥血清Ⅳ組與I、Ⅱ、Ⅲ組比較NO有明顯降低(P<0.01)；尿毒癥血清Ⅲ與I組比較NO降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)：尿毒癥血清Ⅲ組與Ⅱ組比較、尿毒癥血清Ⅱ組與I組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(2)培養(yǎng)第24H結(jié)果:

7、尿毒癥血清各組與對(duì)照組比較NO明顯升高(P<0.01);尿毒癥血清Ⅳ與尿毒癥血清Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組比較NO明顯下降(P<0.01);尿毒癥血清Ⅲ組與Ⅰ組Ⅱ組比較NO有下降(P<0.05);尿毒癥血清Ⅱ組與Ⅰ組比較NO無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);尿毒癥血清各組24H與對(duì)應(yīng)的6H組NO值比較均有明顯升高(P<0.05)。 2.HUVEC培養(yǎng)上清液MDA檢測(cè)的結(jié)果。 (1)培養(yǎng)第6H結(jié)果:尿毒癥血清各組與對(duì)照組比較有顯著性升高(P

8、<0.01);尿毒癥血清Ⅲ組與Ⅰ、Ⅱ組比較升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05):尿毒癥血清Ⅳ組與Ⅲ組比較MDA亦有升高(P<0.05);尿毒癥血清Ⅰ、Ⅱ組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 (2)培養(yǎng)第24H結(jié)果:尿毒癥血清各組與對(duì)照組比較MDA有明顯升高(P<0.01);尿毒癥血清Ⅳ組與Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組比較有明顯升高(P<0.01);尿毒癥血清Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組間兩兩比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05):尿毒癥血清各組24H與對(duì)應(yīng)的6H組比較,

9、MDA值升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);尤以尿毒癥血清Ⅳ組升高更為顯著(P<0.01)。 3.HUVEC胞漿INOS表達(dá)的結(jié)果。 培養(yǎng)第24H結(jié)果:尿毒癥血清各組與對(duì)照組比較,胞漿著色加深,INOS表達(dá)率明顯升高(P<0.01);尿毒癥血清Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組間兩兩比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);尿毒癥血清Ⅳ組與Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組比較,胞漿著色明顯變淺,INOS表達(dá)率明顯降低(P<0.01)。 4.HUVEC培養(yǎng)上清液IN

10、OS蛋白水平的結(jié)果(ELISA)。 培養(yǎng)第24h結(jié)果：尿毒癥血清各組與對(duì)照組比較iNOS蛋白明顯升高(P<0.01)，尿毒癥血清III組與II組比較、Ⅳ組與III組比較iNOS蛋白水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；尿毒癥血清III組和I組比較iNOS蛋白降低(P<0.05)。尿毒癥血清Ⅳ與I、II、III組比較iNOS蛋白明顯降低 (P

11、的MDA生成，且隨著血清尿素氮濃度增高呈上升趨勢(shì)。 2.在6h，尿毒癥患者血清可抑制HUVEC的NO生成，且隨著血清尿素氮的升高抑制作用加強(qiáng)，尤以尿素氮≥50mmol/L的尿毒癥血清組更為顯著。 3.在24h,尿毒癥患者血清可激活HUVEC的iNOS，誘導(dǎo)細(xì)胞生成大量的NO；而隨著血清尿素氮濃度增加HUVEC表達(dá)的NO，iNOS呈下降趨勢(shì)，尿素氮≥50mmol/L尿毒癥血清組下降明顯。 4.本實(shí)驗(yàn)提示：尿毒癥患者