巨噬細(xì)胞Coronin-1的表達(dá)與非Mtb源性自噬相關(guān)性的實驗研究.pdf

1、目的：
　　研究巨噬細(xì)胞Coronin-1的表達(dá)與非Mtb源性細(xì)胞自噬的相關(guān)性及其可能信號通路。
　　方法：
　　1.構(gòu)建過表達(dá)Coronin-1的質(zhì)粒pEGFP-C1-Coronin-1，并將其轉(zhuǎn)染至RAW264.7細(xì)胞，通過G418加壓篩選其RAW264.7細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株，即Coronin-1高表達(dá)細(xì)胞株（RAW264.7-Cor.Plus）。
　　2.構(gòu)建干擾Coronin-1表達(dá)的質(zhì)粒pGenesil-1

2、-Coronin-1，并將其轉(zhuǎn)染至RAW264.7細(xì)胞，通過G418加壓篩選其RAW264.7細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株，即Coronin-1低表達(dá)細(xì)胞株（RAW264.7-Cor.Minus）。
　　3.將表達(dá)不同水平Coronin-1的三組細(xì)胞（空白RAW264.7細(xì)胞組、RAW264.7-Cor.Plus組和RAW264.7-Cor.Minus組）分別以完全培養(yǎng)基（空白處理對照）、饑餓、雷帕霉素、環(huán)孢素A等因素處理后，通過RT-PCR法

3、檢測Beclin-1基因的轉(zhuǎn)錄水平，Western-blot法檢測Beclin-1、Coronin-1、LC3BⅡ/LC3BⅠ的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.經(jīng)雙酶切及測序鑒定，Coronin-1過表達(dá)質(zhì)粒和siRNA質(zhì)粒均構(gòu)建成功；經(jīng)G418加壓篩選后獲得了表達(dá)綠色熒光蛋白的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株，通過RT-PCR法和Western-blot法檢測該細(xì)胞穩(wěn)定篩選株具有過表達(dá)或抑制表達(dá)Coronin-1的特性。
　　2.空白

4、處理三組細(xì)胞，Western-blot法檢測LC3BⅡ/LC3BⅠ的比值：RAW264.7-Cor.Minus組>RAW264.7組>RAW264.7-Cor.Plus組；Western-blot法檢測Beclin-1：RAW264.7-Cor.Minus組>RAW264.7組>RAW264.7-Cor.Plus組；RT-PCR法檢測Beclin-1轉(zhuǎn)錄水平，趨勢同Western-blot。差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

5、　　3.饑餓處理三組細(xì)胞，Western-blot法檢測LC3BⅡ/LC3BⅠ的比值：RAW264.7-Cor.Minus組　　4.雷帕霉素處理RAW264.7細(xì)胞，其Coronin-1蛋白被顯著抑制；雷帕霉素和環(huán)孢素A分別處理RAW264.7-Cor.Plus細(xì)胞，其LC3BⅡ/LC3BⅠ比值明顯較空白處理照組高。差異均具有統(tǒng)計學(xué)

6、意義(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.本研究探索了高、中、低三種Coronin-1表達(dá)水平對巨噬細(xì)胞非Mtb源性自噬的影響。結(jié)果表明，巨噬細(xì)胞Coronin-1與非Mtb源性細(xì)胞自噬具有相關(guān)性。
　　2.在營養(yǎng)充足狀態(tài)下，巨噬細(xì)胞Coronin-1的表達(dá)可抑制細(xì)胞自噬；雷帕霉素可通過抑制Coronin-1的表達(dá)而促進細(xì)胞自噬。
　　3.在饑餓狀態(tài)下，巨噬細(xì)胞Coronin-1的表達(dá)可促進細(xì)胞自噬。