CpG-c41對TLRs信號通路的交互影響及其抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的初步研究.pdf

1、Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)作為機體固有免疫系統(tǒng)中特異性識別結(jié)合外源性/內(nèi)源性病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)的一類模式識別受體(pattern recognition receptors,PRRs),經(jīng)配體結(jié)合活化后誘導(dǎo)宿主發(fā)生先天性免疫應(yīng)答。而病原體攜帶的多種PAMPs誘導(dǎo)的TLRs信號通路間既相互獨立又彼此交匯,交匯時

2、往往表現(xiàn)出復(fù)雜的疊加、協(xié)同或拮抗等交互作用。
　　CpG-c41分子是我們課題組對微生物保守CpG-DNA序列進行高通量測序過程中發(fā)現(xiàn)的無免疫刺激性CpG-DNA片段,它能通過競爭性結(jié)合TLR9受體阻斷其它強刺激性CpG-DNA誘發(fā)的免疫學(xué)效應(yīng)。而前期研究表明,c41分子不僅能阻斷TLR9依賴的炎癥反應(yīng),還能交叉干擾TLR4信號通路,抑制其IL-6的分泌,表現(xiàn)出TLR9無刺激性內(nèi)化交叉干擾其他TLRs通路的能力。因此,本研究不同于

3、以往國內(nèi)外基于TLRs激動劑誘導(dǎo)的通路交互作用研究,避免多條TLRs通路活化對TLRs通路交互研究造成的困難,而是采用課題組新發(fā)現(xiàn)的無免疫刺激性c41分子誘導(dǎo)TLR9形成無刺激性內(nèi)化狀態(tài),全面明確該內(nèi)化對其他TLRs通路活化的交互干預(yù)作用及機制。
　　研究顯示,TLRs通路的交互作用對維持機體免疫穩(wěn)態(tài)有重要作用,其誘發(fā)的過度炎癥反應(yīng)常常會導(dǎo)致免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)功能紊亂,引發(fā)自身免疫性疾病,如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthr

4、itis,RA),系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic Lupus Erythematosus,SLE)等。其中,類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎作為一種自身性免疫系統(tǒng)疾病,是造成人體喪失勞動力與致殘的主要原因之一。目前關(guān)于RA的病因尚不完全清楚,但其發(fā)生、發(fā)展被證實與機體TLRs(如:TLR2、TLR4、TLR7和TLR9)識別結(jié)合多種PAMPs引起的反復(fù)刺激密切相關(guān)。而多種PAMPs介導(dǎo)的TLRs通路同時活化往往導(dǎo)致TLRs通路間的交互作用。因此,基于上述

5、認識,本研究在體外通過Western blot檢測與RA相關(guān)的TLR7通路中,信號分子的活化狀態(tài)變化,明確c41誘導(dǎo)的TLR9無刺激性內(nèi)化交叉干擾TLR7通路的分子機制,體內(nèi)則采用酵母多糖A(zymosanA)構(gòu)建小鼠RA模型,初步觀察c41分子對RA小鼠的抗炎作用,為未來臨床RA的防治提供新的理論依據(jù)和策略。
　　目的：
　　采用本課題組新發(fā)現(xiàn)的無免疫刺激性c41分子誘導(dǎo)TLR9形成無刺激性內(nèi)化狀態(tài),體外、體內(nèi)實驗明確該內(nèi)

6、化其對其他TLRs通路活化的交互影響及機制,并通過構(gòu)建RA小鼠模型初步觀察c41對RA的抗炎作用。
　　方法：
　　1.c41分子對TLRs通路活化的交互作用
　　(1)體外實驗中,ELISA法檢測梯度劑量c41分子分別對TLR1/2,2,3,4,7激動劑刺激RAW264.7細胞24h誘發(fā)炎癥因子TNF-α、IL-6及IFN-β表達的影響。
　　(2)體內(nèi)實驗中,按600mg/kg劑量經(jīng)腹腔注射D-GalN增敏小

7、鼠,而后經(jīng)腹腔注射80μg/kgLPS攻擊昆明小鼠,治療組同時經(jīng)腹腔給予8mg/kgc41。自注射日起,前3天每6h觀察一次,之后每12h觀察一次,觀察c41對LPS攻擊小鼠的死亡保護作用,同時于給藥后2h,經(jīng)小鼠眶后靜脈取血,ELISA法檢測血清中炎癥因子TNF-α、IL-6及IFN-β的表達水平。
　　2.TLR9無刺激性內(nèi)化交叉干擾TLR4信號通路的分子機制研究
　　Western blot法檢測4μMc41分子誘導(dǎo)的

8、TLR9無刺激性內(nèi)化對100ng/mlLPS刺激RAW264.7細胞30min誘發(fā)TLR4信號通路中,信號分子IκB、JNK、ERK1/2、p38和IRF3的活化影響。
　　3.c41分子對RA小鼠抗炎作用的初步研究
　　(1)Western blot法檢測2μMc41分子誘導(dǎo)的TLR9無刺激性內(nèi)化對25μg/mlssRNA83刺激RAW264.7細胞30min誘發(fā)TLR7信號通路中,信號分子IκB蛋白的活化影響。
　

9、　(2)以C57BL/6小鼠為實驗載體,經(jīng)右后足跖中部皮下單次注射9mg/mlZymosanA構(gòu)建小鼠RA模型,并通過小鼠尾靜脈多次注射8mg/kgc41,觀察其對RA小鼠的抗炎作用。
　　結(jié)果：
　　1.c41分子對TLRs通路活化的交互作用
　　(1)梯度劑量的c41分子對30ng/mlPam3CK4和1.0E+08cells/mlHKLM刺激RAW264.7細胞誘導(dǎo)TLR1/2和TLR2通路中TNF-α的表達均無

10、影響(p>0.05),但c41分子對50μg/mlPoly(I:C)和5μg/mlssRNA120刺激誘導(dǎo)TLR3和TLR7通路中TNF-α的表達均有顯著抑制作用(p<0.01),且隨著c41分子劑量的增加,抑制作用呈現(xiàn)量效關(guān)系。
　　(2)梯度劑量的c41分子對20ng/mlLPS刺激誘導(dǎo)TLR4通路中TNF-α的表達無影響(p>0.05),但對TLR4通路中IL-6和IFN-β的表達有顯著的抑制作用(p<0.01),且呈現(xiàn)出量

11、效關(guān)系。
　　(3)體內(nèi)研究結(jié)果顯示,8mg/kgc41分子對80μg/kgLPS攻擊昆明小鼠具有死亡保護作用,小鼠生存率得以提高,同時c41分子還可顯著降低模型小鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-6及IFN-β的表達(p<0.01)。
　　2.TLR9無刺激性內(nèi)化交叉干擾TLR4信號通路的分子機制研究
　　Western blot結(jié)果表明,4μMc41分子可抑制100ng/mlLPS刺激RAW264.7細胞30min

12、誘導(dǎo)TLR4通路中信號分子IκB蛋白的磷酸化降解,但對通路中信號分子JNK、ERK1/2、和p38的活化無影響作用。遺憾的是未能檢測到IRF3的磷酸化表達。
　　3.c41分子對RA小鼠抗炎作用的初步研究
　　(1)Western blot檢測與RA相關(guān)的TLR7通路中,c41分子誘導(dǎo)的TLR9無刺激性內(nèi)化對TLR7通路活化的影響。結(jié)果表明,2μMc41分子可抑制25μg/mlssRNA83刺激RAW264.7細胞30min

13、誘導(dǎo)TLR7通路中,信號分子IκB蛋白的磷酸化降解。
　　(2)經(jīng)C57BL/6小鼠右后足跖中部皮下單次注射9mg/ml酵母多糖構(gòu)建小鼠RA模型,2d后即可觀察到小鼠足趾注射處明顯紅腫,局部糜爛,表明造模成功。同時,治療組RA小鼠經(jīng)尾靜脈多次給予8mg/kg的c41,結(jié)果表明,c41對RA小鼠具有抗炎的治療作用,類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎癥狀減輕,表現(xiàn)為紅腫減弱,未出現(xiàn)骨關(guān)節(jié)變形,且c41分子對小鼠無副作用。
　　結(jié)論：
　　(1)

14、c41分子誘導(dǎo)的TLR9無刺激性內(nèi)化對不同類型TLRs介導(dǎo)的信號通路具有不同的交互影響。由于TLR1/2、TLR2、胞膜型TLR4和TLR7介導(dǎo)MyD88依賴型通路的活化,而TLR3和內(nèi)膜型TLR4則介導(dǎo)MyD88非依賴型通路的活化,而本研究結(jié)果表明,c41對胞膜型TLRs(TLR1,TLR2)通路依賴的炎癥因子表達無影響作用,但能抑制內(nèi)膜型TLRs(TLR3,TLR7)通路依賴的炎癥因子釋放,表明c41分子誘導(dǎo)的TLR9無刺激性內(nèi)化對

15、其他TLRs通路活化的干擾作用與TLRs通路類型(MyD88依賴型或非依賴型)無關(guān),而與TLRs分布類型(即:胞膜型或內(nèi)膜型)有關(guān),該內(nèi)化可能是通過對其他內(nèi)膜型TLRs介導(dǎo)的上游內(nèi)化過程的爭奪,選擇性交叉干擾抑制經(jīng)內(nèi)膜型TLRs誘發(fā)的炎癥因子釋放,而對胞膜型TLRs誘發(fā)的炎癥因子無抑制作用。
　　(2)體內(nèi)實驗結(jié)果表明,c41分子本身對小鼠而言安全可靠,可顯著降低LPS攻擊小鼠誘發(fā)的體內(nèi)過度炎癥反應(yīng),降低TNF-а、IL-6和IF

16、N-β的分泌表達,避免致死效應(yīng)的產(chǎn)生。
　　(3)TLR4分為胞膜型和內(nèi)膜型,其中,位于內(nèi)體部分的TLR4介導(dǎo)晚期NF-κB的活化,而胞膜部分的TLR4介導(dǎo)早期NF-κB的活化。研究結(jié)果表明,c41分子誘導(dǎo)的TLR9無刺激性內(nèi)化通過交叉干擾TLR4通路信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子IκB的磷酸化降解,抑制晚期NF-κB的活化,從而抑制炎癥因子IL-6的釋放。但是,TLR9無刺激性內(nèi)化對TLR4通路MAPK級聯(lián)的信號分子JNK、ERK1/2和p38的

17、活化無影響,不能交叉干擾TLR4通路介導(dǎo)的早期誘導(dǎo)的TNF-α的釋放。遺憾的是未能檢測到IRF3的磷酸化表達。上述結(jié)論表明,c41分子誘導(dǎo)的TLR9無刺激性內(nèi)化狀態(tài)能夠交叉抑制內(nèi)膜型TLR4誘發(fā)的炎癥因子釋放,對胞膜型TLR4誘發(fā)的炎癥因子無抑制作用。
　　(4)體外Western blot檢測結(jié)果表明,c41分子誘導(dǎo)的TLR9無刺激性內(nèi)化能夠交叉干擾TLR7通路,抑制通路中信號分子IκB的磷酸化降解,從而抑制下游炎癥因子表達。因