CpG-c41對(duì)內(nèi)膜型TLRs的交互干擾及其機(jī)制探究.pdf

1、Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是固有免疫系統(tǒng)中一類重要的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors，PRRs)，通過識(shí)別病原相關(guān)模式分子(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)啟動(dòng)一系列炎癥反應(yīng)，以清除入侵的病原體。病原體攜帶的多種PAMPs往往同時(shí)活化多種TLRs，由于不同的TLRs介導(dǎo)的下游信號(hào)通路，彼此之間相互獨(dú)立

2、，但又存在共同的匯聚點(diǎn)，由此，多種TLRs介導(dǎo)的信號(hào)之間就會(huì)發(fā)交互串?dāng)_，表現(xiàn)出相互疊加、相互協(xié)同或相互拮抗等不同的免疫效應(yīng)。這對(duì)免疫調(diào)節(jié)具有特別的意義，然而，其背后的作用機(jī)制仍不完全清楚。
　　一般情況下，TLRs所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)能夠幫助機(jī)體清除病原體，維持免疫穩(wěn)態(tài)。但是，如果TLRs被過度激活，就會(huì)導(dǎo)致自身免疫疾病的發(fā)生。前期研究中我們課題組發(fā)現(xiàn)的無免疫刺激性CpG-ODN c41分子，一段包含未甲基化CpG結(jié)構(gòu)的20bp寡聚核

3、苷酸(CpG-ODN)序列（5'-TGGCGCGCACCCACGGCCTG-3'），作為TLR9的拮抗劑，能夠保護(hù)小鼠免受刺激性CpG-ODN的攻擊，表現(xiàn)出一定的抗炎作用。本研究利用TLR9拮抗劑CpG-c41分子，在不激活TLR9信號(hào)通路的條件下，探究CpG-c41與其他TLRs間的交互作用，并利用CpG-c41的無免疫刺激性，從一個(gè)全新的視角，探究其交互串?dāng)_機(jī)制，拓展我們對(duì)固有免疫中TLRs間免疫調(diào)節(jié)模式的理解。
　　目的:<

4、br>　　明確TLR9拮抗劑CpG-c41分子對(duì)其他TLRs的交互影響，利用CpG-c41的無免疫刺激性，明確交互影響發(fā)生的環(huán)節(jié)和作用機(jī)制。
　　方法:
　　1.通過ELISA實(shí)驗(yàn)觀察CpG-c41對(duì)TLR1/2激動(dòng)劑Pam3 CSK4、TLR2激動(dòng)劑HKLM、TLR3激動(dòng)劑poly(I∶C)、TLR7/8激動(dòng)劑ssRNA120和TLR9激動(dòng)劑CpG-1826誘導(dǎo)的前炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6釋放的影響，明確CpG-c

5、41分子與其他TLRs間的交互作用。
　　2.通過激光共聚焦顯微鏡，觀察CpG-c41分子的吞噬入胞，掌握CpG-c41的內(nèi)化過程;利用免疫熒光技術(shù)探究CpG-c41入胞后的轉(zhuǎn)運(yùn)過程;采用CpG-c41雙標(biāo)熒光探針（3'Cy3作為熒光報(bào)告基團(tuán)、5'BHQ-1作為熒光淬滅基團(tuán)）研究CpG-c41在胞內(nèi)的代謝過程。
　　3.利用免疫熒光技術(shù)，觀察比較CpG-c41和其他TLR激動(dòng)劑內(nèi)化競(jìng)爭(zhēng)和受體競(jìng)爭(zhēng)情況，探究CpG-c41交互串

6、擾的具體作用機(jī)制。
　　4.通過ELISA實(shí)驗(yàn)，探究CpG-c41是否影響激動(dòng)劑誘導(dǎo)Raw264.7細(xì)胞釋放前炎癥細(xì)胞因子TNF-α，明確CpG-c41對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞的免疫應(yīng)答能力的影響。
　　結(jié)果:
　　1.CpG-c41分子能夠有效抑制TLR3、TLR7/8和TLR9（內(nèi)膜型TLRs）誘導(dǎo)的前炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6的釋放，但不影響TLR1和TLR2（胞膜型TLRs）誘導(dǎo)的TNF-α、IL-6的釋放。

7、>　　2.3'Cy3-c41（3'端標(biāo)記Cy3的CpG-c41，紅色標(biāo)記）作用Raw264.7細(xì)胞5min后，胞內(nèi)開始出現(xiàn)紅色熒光，之后紅色熒光分子逐漸增多，約11h后胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度達(dá)到峰值，隨后趨于穩(wěn)定，進(jìn)入平臺(tái)期，呈飽和狀態(tài)。
　　3.胞內(nèi)的3'FAM-c41（3'端標(biāo)記FAM的CpG-c41，綠色標(biāo)記）達(dá)飽和狀態(tài)后，再加入3'Cy3-c41，發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)的綠色熒光逐漸減弱，紅色熒光逐漸增強(qiáng)，即先前內(nèi)化的3'FAM-c41出胞，而

8、環(huán)境中的3'Cy3-c41繼續(xù)入胞，說明CpG-c41達(dá)平臺(tái)期后處于一種動(dòng)態(tài)平衡過程。
　　4.不同熒光標(biāo)記的CpG-c41作用細(xì)胞后，對(duì)于Cy3標(biāo)記，無論Cy3標(biāo)記在CpG-c41的3'端，還是5'端，均能觀察到胞內(nèi)出現(xiàn)紅色熒光;對(duì)于FAM標(biāo)記，可以觀察到3'FAM-c41和5'3'FAM-c41（5'，3'端同時(shí)標(biāo)記FAM的CpG-c41）入胞后的熒光分布，但是，觀察不到5'FAM-c41的綠色熒光，而5'FAM-c41仍然能

9、有效抑制CpG-1826釋放前炎癥因子TNF-α，說明5'FAM-c41依然入胞，只是通過磷酸二酯鍵連接的5'FAM發(fā)生了類似于核酸外切酶的作用，熒光基團(tuán)在入胞的過程中丟失了。
　　5.CpG-c41雙標(biāo)熒光探針（同時(shí)標(biāo)記熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)）作用Raw264.7細(xì)胞40min后，胞內(nèi)開始出現(xiàn)紅色熒光分子，說明CpG-c41作用細(xì)胞40min后開始降解;CpG-c41內(nèi)化7min后定位于網(wǎng)格蛋白，15min與早期內(nèi)體共定位，30mi

10、n與溶酶體共定位，提示CpG-c41的內(nèi)化轉(zhuǎn)運(yùn)需要網(wǎng)格蛋白的參與，首先轉(zhuǎn)運(yùn)到早期內(nèi)體，30min后轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體，40min后開始降解。
　　6.CPG-1826和CpG-c41都與TLR9存在共定位現(xiàn)象。與3'Cy3標(biāo)記的CPG-1826組相比，CpG-c41加入后，CPG-1826與TLR9無共定位現(xiàn)象。
　　7.用FITC標(biāo)記的Poly(I∶C)作用Raw264.7細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)5min后胞內(nèi)出現(xiàn)綠色熒光分子，之后逐漸增多;

11、用FITC標(biāo)記的Poly(I∶C)、3'Cy3-c41同時(shí)作用Raw264.7細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)5min后胞內(nèi)出現(xiàn)紅色熒光分子3'Cy3-c41，6h后才觀察到綠色熒光分子即FITC標(biāo)記的Poly(I∶C)。與單獨(dú)的FITC標(biāo)記的Poly(I∶C)相比，CpG-c41的加入使Poly(I∶C)的入胞時(shí)間延遲了。
　　8.ssRNA120經(jīng)DOTAP包裹后，有效誘導(dǎo)HEK293/TLR7和HEK293/TLR8細(xì)胞釋放炎癥因子IL-8，Cp

12、G-c41的加入明顯抑制了IL-8的釋放;當(dāng)ssRNA120和CpG-c41同時(shí)用DOTAP包裹后，CpG-c41同樣能干擾ssRNA120對(duì)TLR7和TLR8的活化，說明干擾環(huán)節(jié)與胞膜資源爭(zhēng)奪無關(guān)。
　　9.免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明，3'Cy3-c41與TLR7、TLR8存在明顯的共定位現(xiàn)象。
　　10.在只表達(dá)TLR3，TLR7，TLR8和TLR9，不表達(dá)CD14的HEK293細(xì)胞中，CpG-c41的加入明顯抑制上述相應(yīng)激動(dòng)劑誘

13、導(dǎo)的NF-κB的活化。
　　11.分別給予激動(dòng)劑Poly(I∶C)/ssRNA120/CpG-1826初次刺激，Raw264.7細(xì)胞再次接受Poly(I∶C)/ssRNA120/CpG-1826刺激后，TNF-α的釋放量較Medium組明顯減少，即TLR激動(dòng)劑的刺激會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞免疫應(yīng)答能力衰減;然而，當(dāng)初次給予Medium或CpG-c41處理，細(xì)胞再次接受Poly(I∶ C)/ssRNA120/CpG-1826刺激后，與Medium

14、組相比，CpG-c41組正常釋放TNF-α，即CpG-c41與Medium一樣，不影響細(xì)胞免疫應(yīng)答能力。
　　結(jié)論:
　　1.CpG-c41選擇性干擾內(nèi)膜型TLRs活化，對(duì)胞膜型TLRs沒有影響。
　　CpG-c41發(fā)揮的多重免疫抑制效應(yīng)與TLRs的分布有關(guān)。雖然胞膜型TLR1、TLR2與內(nèi)膜型TLR7/8和TLR9均依賴MyD88信號(hào)通路，但CpG-c41選擇性干擾內(nèi)膜型TLRs，而對(duì)胞膜型TLRs無影響。另一方面，

15、盡管TLR3與TLR7/8、TLR9下游信號(hào)通路不同，但CpG-c41均能抑制這幾種內(nèi)膜型TLR的活化。由此說明，CpG-c41的交互干擾效應(yīng)與TLRs下游信號(hào)通路無關(guān)，其串?dāng)_發(fā)生在信號(hào)級(jí)聯(lián)啟動(dòng)以前。
　　2.CpG-c41的內(nèi)化轉(zhuǎn)運(yùn)代謝過程。
　　3'Cy3-c41作用Raw264.7細(xì)胞5min后開始入胞，約11h后進(jìn)入平臺(tái)期，呈飽和狀態(tài)。在CpG-c41吞噬入胞的過程中，5'末端5'碳位點(diǎn)發(fā)揮了關(guān)鍵作用。CpG-c41

16、內(nèi)化15min后轉(zhuǎn)運(yùn)到早期內(nèi)體，30min后轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體，40min左右開始降解。由此，CpG-c41的干預(yù)環(huán)節(jié)發(fā)生在CpG-c41內(nèi)化入胞大致40min之前。CpG-c41的內(nèi)化是一種動(dòng)態(tài)過程，即先前入胞的分子及降解產(chǎn)物不會(huì)在胞內(nèi)滯留，提示CpG-c41的干擾效應(yīng)與內(nèi)體飽和無關(guān)。
　　3.CpG-c41對(duì)內(nèi)膜型TLRs的干擾機(jī)制
　　針對(duì)不同的TLR，CpG-c41的干預(yù)方式也不相同，在入胞階段，CpG-c41通過與TLR

17、3激動(dòng)劑Poly(I∶C)競(jìng)爭(zhēng)入胞干擾TLR3活化;在識(shí)別階段，CpG-c41通過與TLR7/8或TLR9競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合發(fā)揮干擾作用。以往普遍認(rèn)為TLR7/8特異性識(shí)別ssRNA，但本研究發(fā)現(xiàn)它們也能識(shí)別ssDNA，說明TLR7/8對(duì)配體識(shí)別的特異性是相對(duì)的，具有一定的兼容性。
　　此外，CD14作為這四種內(nèi)膜型TLRs一種共同的輔助受體，極有可能參與了交互干擾過程。本研究明確地排除了CD14參與CpG-c41的多重免疫抑制效應(yīng)。