miRNA-93調(diào)控Ⅰ型干擾素通路的作用機(jī)制及其體內(nèi)效應(yīng)的研究.pdf

1、機(jī)體在病毒感染中的免疫反應(yīng)機(jī)制是免疫研究的熱點(diǎn)。病毒感染機(jī)體后，存在著機(jī)體如何抵抗病毒的侵襲、病毒又如何逃逸免疫反應(yīng)的斗爭(zhēng)過程，認(rèn)識(shí)和掌握該機(jī)制對(duì)于病毒感染意義重大。在病毒感染過程中，免疫細(xì)胞可以通過模式識(shí)別受體識(shí)別病毒成分，進(jìn)而活化下游信號(hào)途徑，表達(dá)Ⅰ型干擾素(interferon，IFN)和促炎癥細(xì)胞因子，進(jìn)而發(fā)揮重要的抗病毒作用。Ⅰ型干擾素作為一類重要的細(xì)胞因子，有著廣泛的生理活性，參與抗感染、抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)作用，并在抗病毒免

2、疫中發(fā)揮特別重要的作用;另一方面，病毒也常常作用于Ⅰ型干擾素信號(hào)途徑，實(shí)現(xiàn)免疫逃逸，促進(jìn)自身在體內(nèi)的表達(dá)。目前，Ⅰ型干擾素已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床疾病的免疫治療中，然而根據(jù)流行病學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型干擾素在不同類型的病毒感染治療中效果差異很大，但導(dǎo)致Ⅰ型干擾素治療不同類型的病毒感染效果差異的機(jī)制仍然不清楚，因此，深入研究與認(rèn)識(shí)干擾素的表達(dá)及其下游信號(hào)的調(diào)控機(jī)制，具有重要的科學(xué)意義。
　　 Micro-RNAs(miRNA)對(duì)免疫細(xì)胞的調(diào)控

3、機(jī)制是近年來免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)。miRNA是細(xì)胞內(nèi)一類表達(dá)豐富、非編碼的高度保守的RNA片段，長(zhǎng)度一般為18-25nt。miRNAs表現(xiàn)出一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)的全新機(jī)制，它通過結(jié)合靶基因的mRNA的3'UTR區(qū)域抑制基因的表達(dá)。目前miRNA的研究已成為生命科學(xué)研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)，但目前仍然只有一小部分miRNA生物學(xué)功能得到闡明，這些miRNA調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、組織分化，因而與生命過程中發(fā)育、疾病高度有關(guān)，并在炎癥反應(yīng)和腫瘤的發(fā)生等多種生

4、理與病理過程中發(fā)揮作用。我們通過高通量miRNA芯片篩選，發(fā)現(xiàn)在VSV(vesicular stomatitis virus)感染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的過程中，胞內(nèi)miR-93的表達(dá)顯著降低，我們對(duì)miR-93的生物學(xué)功能及其作用機(jī)制進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)miR-93具有調(diào)控干擾素信號(hào)通路并影響病毒感染的作用。
　　 第一部分、RNA病毒感染通過RIG-I/JNK途徑誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞下調(diào)表達(dá)miR-93
　　 首先我們通過RT-PCR

5、實(shí)驗(yàn)證實(shí)了RNA病毒感染后miR-93的下調(diào)，并研究了RNA病毒感染后miR-93發(fā)生下調(diào)的機(jī)制。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在VSV或SeV病毒感染后，miR-93在巨噬細(xì)胞中會(huì)出現(xiàn)下調(diào)表達(dá);分析臨床流感感染患者的樣本miR-93的表達(dá)發(fā)現(xiàn):在甲型流感病毒感染的病人的PBMC中，miR-93也發(fā)生了下調(diào)，提示病毒感染后miR-93的改變具有臨床病理意義。研究病毒感染后miR-93表達(dá)改變的機(jī)理，分別采用TLR3、TLR4、TLR9或Myd88缺陷的小鼠腹

6、腔巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)VSV感染后miR-93的表達(dá)下調(diào)趨勢(shì)沒有改變，從而排除TLR信號(hào)對(duì)于miR-93表達(dá)的影響;而用RIG-Ⅰ缺陷的小鼠巨噬細(xì)胞，病毒感染后未出現(xiàn)miR-93表達(dá)的下調(diào)，由此可推斷巨噬細(xì)胞感染病毒miR-93的下調(diào)是RIG-Ⅰ依賴的。作為對(duì)照，LPS誘導(dǎo)的miR-93的表達(dá)下調(diào)在RIG-Ⅰ缺陷的巨噬細(xì)胞中沒有影響，而LPS誘導(dǎo)后miR-93的下調(diào)在TLR4缺陷的腹腔巨噬細(xì)胞中被阻斷。進(jìn)一步采用PRR信號(hào)通路抑制劑，我們發(fā)現(xiàn)

7、巨噬細(xì)胞感染VSV后miR-93表達(dá)的下調(diào)依賴于JNK通路;采用ChIP研究miR-93啟動(dòng)子區(qū)，發(fā)現(xiàn)rniR-93的下調(diào)與其啟動(dòng)子區(qū)組蛋白的H3K4位點(diǎn)的甲基化和H3K27的去甲基化有關(guān)。
　　 第二部分:VSV感染后機(jī)體通過下調(diào)表達(dá)miR-93增強(qiáng)Ⅰ型干擾素的下游信號(hào)從而抑制病毒復(fù)制
　　 為了探討RNA病毒感染后miR-93下調(diào)的生物學(xué)意義，我們分析了巨噬細(xì)胞表達(dá)的miR-93對(duì)VSV復(fù)制的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)高表達(dá)mi

8、R-93可增強(qiáng)VSV在細(xì)胞中的復(fù)制，顯著增加細(xì)胞培養(yǎng)上清中的病毒量。
　　 為了探究miR-93病毒與病毒復(fù)制相互作用的分子機(jī)制，我們首先觀察了miR-93的上調(diào)表達(dá)是否會(huì)影響到Ⅰ型干擾素本身的產(chǎn)量。mRNA和蛋白水平的結(jié)果都顯示，miR-93 mimics與inhibitor對(duì)于VSV誘導(dǎo)的IFN-β、TNF-α、I(1)-6等細(xì)胞因子的產(chǎn)量不發(fā)生影響，同時(shí)IRF3、NF-κB、P38、ERK、JNK等的磷酸化程度也沒有發(fā)生變

9、化。于是我們將研究點(diǎn)著重于分析Ⅰ型干擾素下游信號(hào)的變化。已有的研究結(jié)果顯示VSV病毒感染會(huì)引起STAT1分子的磷酸化，并在24小時(shí)候達(dá)到最高峰。Western結(jié)果顯示miR-93高表達(dá)后STAT1的磷酸化水平被抑制。使用IFN-β刺激高表達(dá)miR-93的巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Ⅰ型干擾素途徑的下游基因ISG15和IP10的表達(dá)也被抑制。以上結(jié)果提示，miR-93是通過抑制了Ⅰ型干擾素途徑的下游信號(hào)發(fā)揮了促進(jìn)病毒復(fù)制作用，對(duì)于干擾素本身的產(chǎn)量沒有影

10、響。
　　 第三部分:miR-93通過靶向JAK1蛋白調(diào)控Ⅰ型干擾素的信號(hào)傳遞過程
　　 接下來我們探討了miR-93作用于哪個(gè)靶分子發(fā)揮了抑制JAK/STAT通路及其下游信號(hào)的作用。通過TargetScan(www.targetscan.org)在線軟件，我們發(fā)現(xiàn)miR-93在JAK1的3'UTR區(qū)域的861-867與1085-1091區(qū)域存在保守的靶位點(diǎn)。而JAK1蛋白是JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵信號(hào)分子，

11、所以我們推測(cè)，在VSV刺激巨噬細(xì)胞后miR-93的下調(diào)是促進(jìn)了JAK1蛋白的翻譯。于是我們通過RT-PCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-93在巨噬細(xì)胞中高表達(dá)后，JAK1蛋白的mRNA與蛋白水平均發(fā)生下降。而雙熒光報(bào)告的結(jié)果也證明了miR-93可以靶向JAK1的3'UTR區(qū)域發(fā)揮作用。
　　 為了進(jìn)一步證明miR-93對(duì)于Ⅰ型干擾素通路的作用靶點(diǎn)是JAK1，我們采用JAK1siRNA和JAK1高表達(dá)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)J

12、AK1的干擾RNA可以起到和高表達(dá)miR-93相似的作用，即促進(jìn)VSV病毒的復(fù)制。而miR-93 inhibitor對(duì)于IFN-β誘導(dǎo)的ISG15的上調(diào)表達(dá)也能被JAK1的siRNA所阻斷。通過構(gòu)建高表達(dá)JAK1(不含3'UTR)的RAW264.7穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，在VSV刺激后，miR-93無法調(diào)控JAK/STAT通路及其下游而發(fā)揮抗病毒作用，進(jìn)一步證實(shí)miR-93靶向作用JAK1來調(diào)控Ⅰ型干擾素通路從而影響病毒的復(fù)制。
　　 第四

13、部分:病毒感染后機(jī)體表達(dá)miR-93調(diào)控JAK/STAT通路及其體內(nèi)的效應(yīng)研究
　　 為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-93的體內(nèi)效應(yīng)，我們合成了膽固醇修飾的miR-93體內(nèi)運(yùn)載試劑Agomir-93(廣州市銳博生物科技)，并通過尾靜脈注射使小鼠體內(nèi)高表達(dá)miR-93。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠體內(nèi)高表達(dá)miR-93后感染VSV病毒，可顯著降低肝、肺、脾中的JAK1蛋白表達(dá);肺部組織切片分析顯示，miR-93高表達(dá)后肺中的有核細(xì)胞數(shù)顯著增加，肺泡結(jié)