miRNA和RNAi對(duì)HPV相關(guān)腫瘤的調(diào)控作用及干擾素誘導(dǎo)蛋白p204調(diào)節(jié)骨發(fā)育的分子機(jī)制.pdf

1、MicroRNAs(miRNAs)是非編碼的小RNAs，在動(dòng)物、植物和真菌的轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)節(jié)中起重要的作用。目前，已知病毒也可產(chǎn)生miRNAs。為研究人乳頭瘤病毒是否也可編碼miRNAs，用生物信息學(xué)的方法預(yù)測(cè)HPV16基因組miRNA前體及其成熟的miRNAs。序列分析表明HPVl6可編碼一個(gè)pre-miRNAs。然后以pre-miRNAs推論出的成熟miRNA序列在3’UTR數(shù)據(jù)庫中尋找靶基因。候選miRNA前體可被切割成推定的3個(gè)成

2、熟的19-22堿基的miRNAs。通過在基因庫內(nèi)進(jìn)行序列類比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)很多候選的細(xì)胞和病毒的靶基因(如HPVl6 L1)可不完全的結(jié)合這些病毒編碼的vmiRNA序列，因此有可能潛在抑制這些基因mRNA的翻譯。克隆HPV16vmiRNA的表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)細(xì)胞中MycBF-2的表達(dá)水平的差異，結(jié)果表明HPV16 vmiRNA的表達(dá)可使Hela細(xì)胞內(nèi)的mRNA水平下降2-3倍。這些數(shù)據(jù)表明HPV16編碼的病毒mi

3、RNAs可能參與調(diào)節(jié)細(xì)胞和病毒自身的基因表達(dá)。本研究將為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證HPV16 miRNAs的調(diào)節(jié)基因的作用奠定基礎(chǔ)。 小干涉RNA(small interfering RNA：siRNA)是一種序列特異性地轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的調(diào)節(jié)因子，誘導(dǎo)序列特異的目標(biāo)基因的沉默，強(qiáng)大而迅速地阻斷基因活性，可用于抑制癌蛋白表達(dá)的宮頸癌的基因治療。為了構(gòu)建HPV16E6癌基因特異的U6質(zhì)粒表達(dá)質(zhì)粒，合成不同序列的siRNA，并進(jìn)一步優(yōu)化其抑制HP

4、V病毒癌基因表達(dá)及其對(duì)子宮頸癌細(xì)胞生長繁殖的效應(yīng)，選擇4個(gè)分別針對(duì)HPV16 E6 mRNA外顯子和內(nèi)含子序列為靶序列，合成DNA鏈，構(gòu)建表達(dá)HPV16 E6短發(fā)卡樣dsRNA的重組pSilencer1.0-U6載體，導(dǎo)入HPV-16 DNA陽性的宮頸癌細(xì)胞株CaSki中，觀察該細(xì)胞中HPV-16 E6、E7基因表達(dá)水平及其蛋白含量的變化，并觀察細(xì)胞生長被抑制的情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)四種HPV-16 E6 siRNA均能降低宮頸癌細(xì)胞CaSki

5、的生長速率。通過細(xì)胞生長曲線觀察到HPV16E6 shRNA表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞0-96 h內(nèi)，可降低細(xì)胞生長速度。熒光定量RT-PCR檢測(cè)HPVl6 E6 siRNA可使宮頸癌細(xì)胞株CaSki中HPV-16 E6、E7基因轉(zhuǎn)錄的mRNA水平降低，其中針對(duì)E6 mRNA內(nèi)含子的重組shRNA只抑制E6基因的表達(dá)水平。Western blot分析表明4個(gè)HPV-16 E6 shRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HPV16相關(guān)宮頸癌細(xì)胞作用72hrs后，未能檢

6、測(cè)到宮頸癌細(xì)胞中HPV-16 E6蛋白。由此可見，HPV16E6 siRNA能使宮頸癌細(xì)胞CaSki生長緩慢；選擇針對(duì)E6內(nèi)含子的siRNA作用位點(diǎn)，特異性抑制E6表達(dá)；而針對(duì)E6外顯子的siRNA作用位點(diǎn)，可抑制E6和E7基因的表達(dá)，是用于治療HPV陽性宮頸癌細(xì)胞的理想靶位。骨形成是多種因子協(xié)同調(diào)節(jié)多種骨特異性基因表達(dá)的過程。骨發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)涉及復(fù)雜的信號(hào)分子網(wǎng)絡(luò)，其中轉(zhuǎn)錄因子Cbfal是一種關(guān)鍵的調(diào)節(jié)骨特異基因(如osteopo

7、ntin和osteocalcin)表達(dá)的因子，在骨發(fā)育中發(fā)揮不可替代的調(diào)控作用。喪失Cbfal的調(diào)節(jié)功能可引發(fā)骨質(zhì)疏松癥(OSteoporosis)和骨硬化病(osteopetrosis)等代謝性骨病。成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白(Retinoblastoma protein，pRb)被發(fā)現(xiàn)是cbfal誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化的共同活化因子，并且是介導(dǎo)骨發(fā)育所必需的。本研究組近期報(bào)道一種干擾素誘生蛋白p204與Cbfal的調(diào)節(jié)功能相關(guān)，作為Cbfal的共

8、同活化因子可增強(qiáng)骨的形成。 本研究進(jìn)一步通過重組腺病毒Ad-p204As編碼反義p204 RNA抑制p204的表達(dá)后，多向分化潛能骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞系(pluripotent Mesenchymal stem cell line)C2C12喪失了Cbfal對(duì)成骨細(xì)胞特異性基因的誘導(dǎo)活化，揭示在骨形成中p204的誘導(dǎo)表達(dá)是Cbfal依賴性的基因活化表達(dá)所必需的。用多重蛋白免疫共沉淀和GST-pull-down實(shí)驗(yàn)揭示，p204，Rb

9、和Cbfal可形成三蛋白的復(fù)合體，Rb作為一個(gè)連接子分別結(jié)合p204和Cbfal。而且通過染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)(chromatin immunoprecipitation)在osteocalcin基因的啟動(dòng)子上可檢測(cè)出該：p204/Rb/Cbfal轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。缺失Rb結(jié)合位點(diǎn)的p204突變體失去了增強(qiáng)Cbfal依賴性的轉(zhuǎn)錄活性和骨形成；另外，通過報(bào)告基因和體外骨發(fā)生實(shí)驗(yàn)表明，p204和Rb共同協(xié)同增強(qiáng)Cbfal依賴的基因活化和成骨細(xì)胞分化

10、，由此可見Rb是p204激活Cbfal活性的作用所必需的。上述結(jié)果表明在BMP-2信號(hào)作用下，Rb和p204在Cbfal介導(dǎo)的骨形成過程中起協(xié)同增強(qiáng)作用，p204/Rb/Cbfal通過Rb作為連接橋形成一個(gè)復(fù)合物，從而發(fā)揮增強(qiáng)骨發(fā)育的生物學(xué)功能。在骨發(fā)育中，轉(zhuǎn)錄因子Cbfal是由BMP-2誘導(dǎo)的一種關(guān)鍵的調(diào)節(jié)骨特異基因(如osteopontin和osteocalcin)表達(dá)的因子，在骨發(fā)育中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。Ids蛋白也是一種BMP-

11、2誘導(dǎo)蛋白，且抑制BMP-2誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞分化，為常見的抑制細(xì)胞分化的因子。為揭示其分子機(jī)制，本研究研究Ids能否與Cbfal相互作用并進(jìn)一步抑制Cbfal的生物功能。用免疫共沉淀和GSI-pull-down實(shí)驗(yàn)揭示，Id2和Cbfal可相互結(jié)合，Id2結(jié)合Cbfal的區(qū)域位于HLH區(qū)，Cbfal結(jié)合Id2的區(qū)域位于N端222-280的片段內(nèi)。通過重組腺病毒．Ade-Id2轉(zhuǎn)導(dǎo)多向分化潛能骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞系(pluripotent Me

12、senchymal stem cell line)C2C12細(xì)胞，抑制了Cbfal對(duì)成骨細(xì)胞特異性基因的誘導(dǎo)活化，并降低了該細(xì)胞內(nèi)ALP活性及細(xì)胞分泌的OCL數(shù)量，揭示在骨形成中，Ids抑制Cbfal的活性。而且通過chromatinimmunoprecipitation實(shí)驗(yàn)在osteocalcin基因的啟動(dòng)子上未能檢測(cè)出該Id2蛋白或Cbfal蛋白或兩者的復(fù)合物，揭示在骨形成中，Ids抑制Cbfal的DNA結(jié)合活性。通過熒光免疫染色技

13、術(shù)發(fā)現(xiàn)Id2蛋白在BMP-2誘導(dǎo)下，1H后在細(xì)胞內(nèi)有表達(dá)蛋白存在，3H時(shí)由細(xì)胞核內(nèi)向細(xì)胞核外轉(zhuǎn)移，6H時(shí)細(xì)胞核內(nèi)的Id2蛋白含量減少，大部分轉(zhuǎn)移至細(xì)胞漿內(nèi)。Western B10t實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Id2蛋白可使BMP-2誘導(dǎo)的C2C12細(xì)胞中的p204和Cbfal水平下降。上述結(jié)果表明在BMP-2信號(hào)作用下，Idl，2，3在Cbfal介導(dǎo)的骨形成過程中起抑制作用，Id2可與Cbfal結(jié)合，從而抑制Cbfal結(jié)合到osteopontin基因的

14、啟動(dòng)子上；另外，Id2降低骨發(fā)育特異的轉(zhuǎn)錄因子Cbfal和骨發(fā)育協(xié)同激活因子p204在骨發(fā)育早期的蛋白水平，從而抑制Cbfal介導(dǎo)的骨發(fā)育過程。Id2是否通過由細(xì)胞核到細(xì)胞漿的轉(zhuǎn)位，從而消除對(duì)Cbfal轉(zhuǎn)錄活性的抑制作用有待進(jìn)一步研究證實(shí)。 綜上所述，本研究內(nèi)容涉及miRNA與siRNA在宮頸癌腫瘤細(xì)胞中的基因調(diào)控作用和骨發(fā)育過程中p204，Rb，Cbfal，Ids四種蛋白之間的相互作用，研究結(jié)果如下： 1．HPVl6病

15、毒可編碼的病毒miRNA，該miRNA的編碼序列位于。HPV16基因組的L1基因3’UTR和LTR內(nèi)，并參與調(diào)節(jié)細(xì)胞和病毒自身的基因表達(dá)。 2．針對(duì)HPVl6E6的siRNA能使宮頸癌細(xì)胞CaSki生長緩慢；選擇針對(duì)E6內(nèi)含子的siRNA作用位點(diǎn)，特異性抑制E6表達(dá)；而針對(duì)E6外顯子的siRNA作用位點(diǎn)，可同時(shí)抑制E6和E7基因的表達(dá)，是用于治療HPV陽性宮頸癌細(xì)胞的理想靶位。 3．在BMP-2信號(hào)作用下，Rb和p204

16、在骨發(fā)育特異的轉(zhuǎn)錄因子Cbfal介導(dǎo)的成骨細(xì)胞形成過程中起協(xié)同增強(qiáng)作用，p204/Rb/Cbfal通過Rb作為連接橋形成一個(gè)復(fù)合物，結(jié)合在骨成熟標(biāo)志基因OCL的啟動(dòng)子DNA上。 4．在BMP-2信號(hào)作用下，Id1，2，3在骨發(fā)育特異的轉(zhuǎn)錄因子Cbfal介導(dǎo)的骨形成過程中起抑制作用，Id2可與Cbfal結(jié)合，從而抑制Cbfal結(jié)合到OCL基因的啟動(dòng)子上；另外，Id2降低Cbfal和骨發(fā)育協(xié)同激活因子p204在骨發(fā)育早期的蛋白水平，