干擾素誘導(dǎo)蛋白P56與GR作用的結(jié)構(gòu)域分析及P56全長重組表達(dá).pdf

1、干擾素(interferon,IFN)誘導(dǎo)蛋白P56是上世紀(jì)七十年代發(fā)現(xiàn)的.P56與GR的相互作用文獻(xiàn)報(bào)道未見,更不知其功能意義.為了尋求能與GR-LBD結(jié)合的更小的P56片段,針對該片段對GR進(jìn)行調(diào)控,減輕過度炎癥反應(yīng)的發(fā)生,該研究在以往的工作基礎(chǔ)上采用酵母雙雜交技術(shù)對P56與GR-LBD相互的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了全面分析,找到了GR與P56相互作用的特定結(jié)構(gòu)域,同時(shí)構(gòu)建了P56的表達(dá)載體,進(jìn)行了初步的誘導(dǎo)表達(dá),其主要結(jié)果如下:一、成功構(gòu)建P

2、56缺失突變體片段酵母表達(dá)質(zhì)粒用IFN誘導(dǎo)HT1080細(xì)胞,提取mRNA、反轉(zhuǎn)錄形成cDNA,設(shè)計(jì)不同的引物,PCR擴(kuò)增獲得P56全長及一系列缺失突變體,與T-Vector連接、轉(zhuǎn)化,挑取陽性克隆,酶切鑒定,P56全長和一系列缺失突變片段分別裝下酵母表達(dá)載體pGADT7,測序,證實(shí)所有序列與設(shè)計(jì)序列完全一致.二、確定P56蛋白與GR結(jié)合的特定結(jié)構(gòu)域采用酵母雙雜交技術(shù),將構(gòu)建的P56全長及一系列缺失突變體片段重組質(zhì)粒與pGBKT7-GRL

3、BD質(zhì)粒兩兩配對共轉(zhuǎn)化入酵母中,選擇三缺培養(yǎng)基SD/-His-Leu-Trp培養(yǎng)(即培養(yǎng)基中無組氨酸、亮氨酸、色氨酸,便于選擇帶有相應(yīng)營養(yǎng)素基因的轉(zhuǎn)化株及篩選基因的功能),ONPG法檢測β-gal活性以判定一個P56缺失突變體與GR-LBD結(jié)合力的大小,確定P56蛋白與GR-LBD相互作用的能力,其結(jié)果顯示P56與GR相互作用的特定結(jié)構(gòu)域在P56的600~957位堿基,即179~296氨基酸區(qū)域(氨基酸位點(diǎn)從第64位堿基算起,而開放閱讀