TDP-43與β-淀粉樣前體蛋白胞內(nèi)結構域相互作用并誘導P53依賴的細胞凋亡.pdf

1、目的:
　　探求TDP-43(TAR DNA-binding protein43)與β-淀粉樣前體蛋白胞內(nèi)結構域(the intracellular domain of Amyloid Precursor Protein,AICD)之間的關系,從而揭示其在阿爾茨海默病病理機制中可能發(fā)揮的作用。
　　方法:
　　1.運用免疫熒光染色方法在HEK293/COS7細胞系上檢測TDP-43與AICD在細胞水平的是否存在共定位。

2、2.在細胞系上轉染克隆質(zhì)粒TDP-43-V5、APP-FLAG,48h后收集細胞提取蛋白,用免疫共沉淀(co-immunoprecipitations)的方法檢測APP(β淀粉樣蛋白前體蛋白)與 TDP-43在蛋白水平是否結合。在野生型C57/BL6J成年小鼠的大腦組織上用免疫共沉淀方法證明內(nèi)源性的TDP-43與APP在正常小鼠腦組織中是否存在結合關系。進一步在細胞系上轉染質(zhì)粒TDP-43-V5、AICD-FLAG,以明確TDP-43是

3、否與AICD存在結合關系。3.用雙熒光素酶報告基因測試方法檢測TDP-43對AICD是否存在轉錄作用,進一步加入APPγ酶切位點的分泌酶抑制劑,觀察這種轉錄作用是否有變化。用Real-Time PCR的方法檢測這種轉錄作用對P53 mRNA水平的影響。4.在分別轉染了AICD,TDP-43, AICD+TDP-43的細胞系上計數(shù)Caspase-3陽性細胞,直接比較對細胞凋亡的作用。使用TUNEL法再次重復實驗。
　　結果:

4、　　1.免疫熒光染色,觀察到在體外培養(yǎng)的HEK293/COS7細胞系上,TDP-43在細胞水平定位于胞核,AICD大部分位于胞核,且二者存在共定位關系。2.在細胞系上轉染質(zhì)粒,進一步證明了TDP-43與AICD在蛋白水平存在結合。在野生型C57/BL6J成年小鼠的大腦組織上檢測到內(nèi)源性的TDP-43與AICD存在結合。3. TDP-43對AICD有類似于Fe65樣的轉錄激活作用,但是這種作用可以被加入的APPγ酶切位點的分泌酶抑制劑所阻

5、斷(***p<0.001;NS:無意義)。TDP-43有類似與AICD的作用,增加P53 mRNA的表達水平,從而促進TP53基因編碼的P53蛋白的轉錄作用,且TDP-43可以增強AICD該種轉錄激活作用(*:p<0.05;**:p<0.01;***p<0.001)。4. TDP-43在誘導細胞凋亡方面有與AICD類似的作用,其增加Caspase-3陽性或TUNEL陽性細胞數(shù),促進細胞凋亡;并且TDP-43可以增強AICD誘導細胞凋亡的