副黏病毒V蛋白拮抗MAVS介導(dǎo)的Ⅰ型干擾素通路的研究.pdf

1、新城疫病毒(Newcastle Disease virus，NDV)是副黏病毒科禽腮腺炎病毒屬(AvuLavirus)的禽副黏病毒Ⅰ型(APMV-1)。NDV基因編碼六種主要結(jié)構(gòu)蛋白組成并且研究較多的P基因可以通過RNA編碼產(chǎn)生兩個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白V蛋白和W蛋白。維甲酸誘導(dǎo)基因-Ⅰ(retinoic acid induced gene-Ⅰ，RG-Ⅰ)是識(shí)別病毒RNA激發(fā)Ⅰ型IFN產(chǎn)生的重要傳感器，線粒體抗病毒信號(hào)蛋白MAVS(Mitochon

2、drial antiviral signalingprotein，IPS-1/VISA/Cardif也是它的名稱)蛋白是RIG-Ⅰ樣受體在先天性抗病毒免疫中的接頭蛋白，新城疫病毒感染時(shí)可誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生免疫性干擾素(IFN)來抑制病毒增殖，文獻(xiàn)記載新城疫病毒編碼的V蛋白等多種蛋白阻止IFN的抗病毒功能，因此病毒V蛋白與細(xì)胞MAVS蛋白是否存在相互作用近年來成為新的研究熱點(diǎn)。NDV的V蛋白結(jié)構(gòu)同同類的其他副黏病毒的V蛋白具有相似的特殊結(jié)構(gòu)

3、，發(fā)現(xiàn)副黏病毒通過RNA編碼，產(chǎn)生V蛋白具有阻斷IFN抗病毒活性的功能。
　　已有研究發(fā)現(xiàn)NDVV蛋白對(duì)MAVS信號(hào)通路有降解作用，本實(shí)驗(yàn)通過外源轉(zhuǎn)染副黏病毒V蛋白，檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞MAVS蛋白表達(dá)及IFN-β生成量的影響，結(jié)果說明副黏病毒V蛋白通過泛素-蛋白酶體途徑降解MAVS蛋白，并且病毒是通過MAVS蛋白水平干擾IFN的產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)還通過獲得MAVS不同片段的克隆來研究病毒V蛋白與MAVS的相互作用，發(fā)現(xiàn)副黏病毒V蛋白與MAVS作

4、用的特異性。總之，實(shí)驗(yàn)研究驗(yàn)證病毒V蛋白的在拮抗干擾素中的重要作用。
　　一、NDV誘導(dǎo)MAVS降解，但下游IFN信號(hào)通路仍然激活
　　本研究使用了NDV、SeV感染HeLa6、9、12、24h后檢測(cè)MAVS表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在病毒感染24h降解MAVS。本實(shí)驗(yàn)還證明了NDV以一種劑量依賴效應(yīng)誘導(dǎo)MAVS降解，并且NDV還可以降解外源轉(zhuǎn)染的MAVS。
　　為了驗(yàn)證細(xì)胞感染NDV后MAVS下游信號(hào)通路的激活情況，本實(shí)驗(yàn)在He

5、La細(xì)胞感染NDV3、6、9、12h后Western-Blot檢測(cè)TBK l/p-TBK l/pcbp2/Mavs/p-IRF-3蛋白表達(dá)量，檢測(cè)結(jié)果顯示NDV感染前期不引起p-TBK1、p-IRF-3的激活，而在感染后期激活明顯。結(jié)果表明，影響干擾素產(chǎn)生的TBK1、IRF-3等的激活可能是由其他信號(hào)通路激活引起的，后續(xù)實(shí)驗(yàn)有待進(jìn)一步研究。
　　二、NDV V蛋白降解MAVS
　　研究發(fā)現(xiàn)構(gòu)建NDV的Flag-V基因能夠降解

6、細(xì)胞的MAVS蛋白，為進(jìn)一步的驗(yàn)證是否是NDV的V蛋白在細(xì)胞先天性免疫中發(fā)揮MAVS降解的作用，實(shí)驗(yàn)通過已構(gòu)建的Flag-V蛋白轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞和A549細(xì)胞，檢測(cè)MAVS表達(dá)水平。為了證明RIG-MDA5信號(hào)通路是否被NDV的V蛋白干擾，通過熒光素酶實(shí)驗(yàn)從干擾素啟動(dòng)子水平檢測(cè)轉(zhuǎn)染不同濃度梯度的Flag-V和Flag-MAVS后對(duì)細(xì)胞IFN-β產(chǎn)生的影響，結(jié)果顯示隨著轉(zhuǎn)染Flag-V濃度的升高，在轉(zhuǎn)染Flag-MAVS時(shí)IFN-β產(chǎn)生水

7、平逐漸降低，而轉(zhuǎn)染TLR3下游的接頭蛋白Trif則沒有影響。
　　三、副黏病毒V蛋白降解MAVS
　　研究中我們構(gòu)建副黏病毒的SeV、MEV驗(yàn)證隨著轉(zhuǎn)染V濃度的升高，外源轉(zhuǎn)染MAVS及NDV感染誘導(dǎo)的IFN-β水平是降低。為了進(jìn)一步論證NDVV蛋白能否降解MAVS，本實(shí)驗(yàn)通過實(shí)驗(yàn)室已有的ZJ1病毒V蛋白突變株以及WT感染HeLa細(xì)胞后觀察MAVS降解情況，結(jié)果證明病毒V蛋白缺失后細(xì)胞MAVS蛋白未出現(xiàn)降解情況，也確證了NDV

8、V蛋白對(duì)MAVS的作用。
　　四、NDV通過泛素-蛋白酶體途徑降解MAVS
　　通過293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染HA-K48，24h后感染NDV后做CO-IP實(shí)驗(yàn)，不感染作對(duì)照，觀察是否MAVS為泛素化降解，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染HA-K48后感染NDV的蛋白互作實(shí)驗(yàn)說明是NDV通過蛋白酶體泛素化降解MAVS。MAVS蛋白降解通過兩條通路，一條是蛋白酶體途徑，另一條是通過自噬通路。為了驗(yàn)證這兩個(gè)通路對(duì)NDV感染后對(duì)MAVS降解的影響，本實(shí)驗(yàn)通過用

9、MG132、CQ、E64d/PepstatinA、wortmannin不同濃度處理檢測(cè)MAVS降解是否延遲，結(jié)果顯示自噬阻斷藥物處理HeLa細(xì)胞后并不影響MAVS的降解，而蛋白酶體抑制劑MG132則抑制了MAVS的降解，說明其主要是通過泛素-蛋白酶體途徑降解。
　　五、NDVV蛋白與MAVS的特異性反應(yīng)
　　有研究已證明PCBP2可以與MAVS180-540這一片段相互作用，由于本實(shí)驗(yàn)已排除PCBP2降解MAVS的作用，為了