膽堿能抗炎通路在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種以累及周圍關(guān)節(jié)為主的系統(tǒng)性炎癥性自身免疫病，致殘率高，是造成我國人群喪失勞動力和致殘的主要疾病之一。近年研究表明炎癥細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)在RA的滑膜炎癥及骨質(zhì)破壞中起到重要作用，是使RA病變持續(xù)存在、遷延進(jìn)展的關(guān)鍵因素。腫瘤壞死因子(TNF)-α和白介素(IL)-1被認(rèn)為是在RA發(fā)病過程中起主要作用的促炎因子。因而，采用多種途徑抑制體內(nèi)促炎因子成為探索RA治療策略的主要思路，并已取得一些令人鼓舞的進(jìn)展。然而，

2、除了TNF-α拮抗劑因其療效確切已經(jīng)進(jìn)入臨床之外，大部分以細(xì)胞因子為靶標(biāo)的干預(yù)措施還處于早期的動物試驗或I期臨床；此外，也有一部分病人對TNF-α拮抗劑的反應(yīng)欠佳；即使是反應(yīng)性較好的病人，要獲得RA的長期控制，也需持續(xù)用藥，或需與經(jīng)典的控制病情藥物聯(lián)用，否則將面臨疾病的復(fù)發(fā)。這些結(jié)果促使人們嘗試尋找新的抑制炎癥介質(zhì)的方法，以求取得更好的療效。 新近研究發(fā)現(xiàn)：在中樞神經(jīng)系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)之間存在一條具有拮抗炎癥反應(yīng)作用的通路-膽堿能抗

3、炎通路，該通路由迷走神經(jīng)及其遞質(zhì)乙酰膽堿和膽堿能受體所構(gòu)成。大量動物實驗結(jié)果表明刺激迷走神經(jīng)和使用膽堿能激動劑煙堿和卡巴堿在內(nèi)毒素血癥、創(chuàng)傷、敗血癥等急性全身性炎癥中可抑制TNF-α、IL-1、IL-6、HMGB1等炎癥因子的生成和釋放，抑制NF-kB信號通路，發(fā)揮抗炎作用。但該通路在慢性炎癥性疾病RA中是否發(fā)揮抗炎作用及作用機(jī)制，目前國內(nèi)外尚未見報道。本研究擬選用SD大鼠，RA患者原代滑膜細(xì)胞為主要材料，以佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠和TNF-α

4、刺激滑膜細(xì)胞誘導(dǎo)炎癥作為主要模型，觀察膽堿能激動劑煙堿對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠及TNF-α誘導(dǎo)的滑膜細(xì)胞炎癥的影響，采用Western blot，RT-PCR，細(xì)胞間接免疫熒光，免疫組化，ELISA等研究手段從整體、細(xì)胞及分子水平探討膽堿能抗炎通路對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的影響。開展本項目研究，可望闡明膽堿能抗炎通路的在RA的抗炎作用及其分子機(jī)制，為RA以及其他炎癥疾病的治療提供新的思路和策略。 目的：探討煙堿對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的炎癥、關(guān)節(jié)破壞

5、的干預(yù)作用和對炎癥因子的影響。 方法：將64只SD大鼠飼養(yǎng)一周后，按體重匹配隨機(jī)分為四組，正常組：注射生理鹽水，每天兩次；模型組：使用完全弗氏佐劑(CFA)造模，注射生理鹽水，每天兩次；大劑量煙堿組：使用CFA造模，腹腔注射0.2mg/kg的煙堿，每天兩次；小劑量煙堿組：使用CFA造模，腹腔注射0.05mg/kg的煙堿，每天兩次。從造模第1天開始腹腔注射。肉眼觀察足腫脹并進(jìn)行關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI)評分，組織病理學(xué)對滑膜炎，放射學(xué)和組

6、織病理學(xué)對關(guān)節(jié)破壞進(jìn)行評分，放射學(xué)評分采用Larsen評分標(biāo)準(zhǔn)。第37天處死所有大鼠，心臟采血，ELISA法檢測血清TNF-α和IL-1β濃度，Western blot檢測血清中HMGB1蛋白水平，免疫組化檢測滑膜和關(guān)節(jié)中HMGB1表達(dá)。 結(jié)果： 1.煙堿對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的保護(hù)作用 (1)造模第24天至32天，大劑量煙堿組關(guān)節(jié)炎發(fā)生率均低于模型組； (2)從大鼠出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹直至實驗結(jié)束，大劑量煙堿組關(guān)節(jié)

7、腫脹均比模型組輕，大劑量煙堿組AI均低于模型組，小劑量組與模型組差異無顯著性； (3)大劑量煙堿組放射學(xué)評分Larsen評分低于模型組，小劑量煙堿組與模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 (4)模型組和小劑量煙堿組滑膜中大量炎性細(xì)胞浸潤，關(guān)節(jié)破壞明顯，大劑量煙堿組滑膜炎性細(xì)胞浸潤較輕，關(guān)節(jié)破壞較輕。大劑量煙堿組滑膜炎評分和關(guān)節(jié)破壞評分低于與模型組。 2.煙堿對全身炎癥因子的影響：大劑量煙堿組血清TNF-α、IL-1β和HMG

8、B1的含量較模型組顯著降低，但仍高于正常組；小劑量組血清TNF-α、IL-1β和HMGB1的含量與模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 3.煙堿對滑膜和關(guān)節(jié)局部炎癥因子HMGB1的影響：正常組滑膜區(qū)和軟骨及骨質(zhì)區(qū)小部分細(xì)胞存在HMGB1表達(dá)，模型組和大小劑量煙堿組滑膜、軟骨和骨質(zhì)部位HMGB1表達(dá)明顯增強(qiáng)。與模型組相比，大劑量煙堿組HMGB1表達(dá)強(qiáng)度顯著降低，小劑量煙堿組與模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論： 1.煙堿可延緩佐劑