DHV-Ⅰ單克隆抗體的制備與膠體金試紙條的研制.pdf

1、鴨病毒性肝炎是由鴨肝炎病毒(DHV,duck hepatitis virus)引起的主要發(fā)生于3周齡以下雛鴨的一種傳播迅速、致死率高的傳染病(Woolcock,P.R.et al.2003)。本課題對(duì)DHV-Ⅰ病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1進(jìn)行了原核表達(dá),制備了抗DHV-Ⅰ的單克隆抗體,研制了檢測(cè)DHV-Ⅰ的膠體金試紙條。
　　 通過RT-PCR方法擴(kuò)增DHV-Ⅰ VP1基因片段,并定向克隆到原核表達(dá)載體pET-32a(+)中,得到的重組質(zhì)

2、粒轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌Rosetta(DE3)PLys中,利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)得到大小為47KD的融合蛋白；Western blot分析發(fā)現(xiàn)該重組蛋白能與抗DHV-Ⅰ陽(yáng)性血清進(jìn)行反應(yīng),具有良好的免疫學(xué)活性。
　　 用純化的DHV-Ⅰ病毒作為抗原免疫BALB/C小鼠并建立了間接ELISA篩選方法。經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)確定了間接ELISA篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株的最佳反應(yīng)條件,即純化的抗原以1:800稀釋,4℃包被過夜,以1:4000稀釋陰、陽(yáng)性血清分

3、別作為陰陽(yáng)性對(duì)照,反應(yīng)條件以37℃90min為最佳,酶標(biāo)二抗的工作濃度為1:1000稀釋。取免疫小鼠脾臟與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合,以建立的間接ELISA篩選方法對(duì)融合的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)篩選,經(jīng)過初檢、二檢、三檢共獲得陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株21株,利用有限稀釋法進(jìn)行了3-4次亞克隆(其中最少有兩次為單克隆)后獲得5株能穩(wěn)定分泌McAb的雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為1E10、4F8、4E6、5G4、5E11。對(duì)這5株雜交瘤細(xì)胞株的穩(wěn)定性、染色體數(shù)、亞類

4、、腹水效價(jià)、特異性進(jìn)行了鑒定,結(jié)果如下:經(jīng)連續(xù)傳代20次和凍存后4個(gè)月復(fù)蘇檢測(cè),其分泌抗體的能力差異不顯著,穩(wěn)定性好；染色體數(shù)介于100～110之間,具有典型的雜交瘤細(xì)胞染色體特征；經(jīng)亞類鑒定,1E10、4F8、4E6、5G4、5E11雜交瘤分泌的抗體類型分別為IgG2b、IgM、IgG1、IgM、IgG1；單抗腹水效價(jià)分別為1:400,1:8000,1:8000,1:32000,1:16000；并具有很好的特異性。
　　 通過

5、硫酸銨沉淀法對(duì)腹水單克隆抗體進(jìn)行純化并測(cè)定了其蛋白含量；在確定標(biāo)記單克隆抗體最低穩(wěn)定量后,成功制備了金標(biāo)單克隆抗體；經(jīng)反復(fù)摸索確定了NC膜最佳包被單克隆抗體的量為1mg/mL,羊抗鼠最佳包被濃度為1:10稀釋,同時(shí)兩者按照1μL/cm噴膜；選擇Ahlstrom8964和GRADE7589分別作為金標(biāo)墊和樣品墊制備膠體金試紙條。分別用樣品稀釋液和病毒液作為陰陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)試紙條,結(jié)果陰性對(duì)照只出現(xiàn)質(zhì)控線而病毒稀釋液出現(xiàn)檢測(cè)線和質(zhì)控線。臨床檢