恩諾沙星單克隆抗體的制備鑒定及其膠體金免疫層析試紙條的研制.pdf

1、目的：制備抗恩諾沙星單克隆抗體，在此基礎上建立酶聯(lián)免疫分析方法，同時研究開發(fā)膠體金免疫層析試紙條檢測恩諾沙星的殘留，為現(xiàn)場快速檢測恩諾沙星的殘留提供新的借鑒和方法。 方法：采用N-羥基琥珀酰亞胺法合成2種人工抗原，采用FeCl3顯色法、MALDI-TOF-MS法對人工抗原進行鑒定同時測定偶聯(lián)比。將免疫抗原腹腔注射免疫BALBC/C鼠，采用雜交瘤技術篩選出特異性分泌抗恩諾沙星單克隆抗體的細胞株并獲取腹水。建立酶聯(lián)免疫分析方法檢測恩

2、諾沙星的殘留，繪制恩諾沙星競爭抑制曲線，確定其檢測限(LOD)、半數(shù)抑制率(IC50)及與其他抗菌藥物的交叉反應率(CR％)，測定恩諾沙星在牛奶、雞蛋、血清中的回收率及變異系數(shù)(CV％)。同時，依據(jù)免疫層析技術研制恩諾沙星殘留檢測的膠體金免疫層析試紙條。 結果：(1)成功合成了2種恩諾沙星人工抗原Enro-BSA與Enro-OVA，F(xiàn)eCl3顯色法結果證明恩諾沙星與BSA及OVA的偶聯(lián)成功，MALDI-TOF-MS法測定Enro

3、-BSA的偶聯(lián)比為13：1。(2)采用雜交瘤技術篩選出2株特異性分泌抗恩諾沙星單克隆抗體的細胞株1A10和4B12并獲取腹水，純化后腹水效價為1：12800000。(3)繪制了恩諾沙星競爭抑制曲線，單抗的最佳稀釋倍數(shù)為1：320000，檢測抗原Enro-OVA工作濃度為37.5ng/ml。標準曲線在0.1～1000ng/ml之間線性關系良好(R2=0.9961)，LOD=0.1ng/ml，IC50=2.6ng/ml。交叉反應結果表明，恩

4、諾沙星與環(huán)丙沙星、馬波沙星及氧氟沙星CR％為0.26％，與諾氟沙星、沙拉沙星、奧比沙星、二氟沙星、達氟沙星CR％小于0.01％，與不同族的氯霉素、慶大霉素、卡那霉素、磺胺二甲基嘧啶、頭孢氨芐等沒有交叉反應。(4)測定牛奶、雞蛋、血清中恩諾沙星的平均添加回收率分別為87.00～110.00％、60.00～77.69％、79.14％～87.00％，CV％分別為4.7～11．2％、7.9～16.9％、3.9～7.1％。(5)膠體金標記恩諾沙星