腎損傷分子-1在單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎組織中表達(dá)及雷帕霉素對(duì)其表達(dá)的影響.pdf

1、目的:腎間質(zhì)纖維化(renalinterstitialfibrosis，RIF)是所有慢性腎臟病的共同結(jié)果，同時(shí)也是造成腎功能不可逆性損害的原因之一，延緩甚至逆轉(zhuǎn)腎間質(zhì)纖維化對(duì)于延緩慢性腎臟病的進(jìn)展、延長(zhǎng)患者壽命意義重大。腎損傷分子(kidneyinjurymolecule(1)，KIM-1)是一種新型的Ⅰ型跨膜糖蛋白，在正常大鼠腎組織僅有極微量的表達(dá)，而在多種急性腎損傷模型中，如缺血再灌注損傷、中毒性腎損傷、造影劑腎病等中表達(dá)明顯增加

2、，且隨腎臟結(jié)構(gòu)和功能的修復(fù)其表達(dá)消退，因其在急性腎損傷診斷中靈敏性和特異性較高，目前成為一種較好的急性腎損傷的生物學(xué)標(biāo)記物。同時(shí)也有研究發(fā)現(xiàn)KIM-1在慢性腎臟病(chronickidneydisease，CKD)時(shí)也有表達(dá)，已在蛋白超負(fù)荷腎病模型、阿霉素腎病、血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)純合子Ren2大鼠腎損傷及多囊腎模型中得到證實(shí)，然而在CKD中KIM-1表達(dá)的具體分子機(jī)制及病理生理學(xué)意義尚不清楚。國(guó)內(nèi)有學(xué)者分別觀察了KIM-1和缺氧誘導(dǎo)因子-

3、1(hypoxia-induciblefactor1alpha，HIF-1α)在造影劑腎病大鼠模型和人近端腎小管上皮細(xì)胞(HK2)缺氧復(fù)氧過(guò)程中的表達(dá)情況及相互關(guān)系，結(jié)果均提示二者之間可能存在一定聯(lián)系，KIM-1可能作為HIF-1α的下游靶點(diǎn)參與腎臟損傷和修復(fù)過(guò)程。本課題擬通過(guò)建立單側(cè)輸尿管梗阻(unilateralureteralobstruction，UUO)大鼠腎間質(zhì)纖維化模型，觀察腎組織的病理改變，結(jié)合免疫組織化學(xué)、PCR等檢測(cè)

4、手段，觀察KIM-1、HIF-1α及α-SMA在腎間質(zhì)纖維化大鼠腎組織中的表達(dá)變化以及應(yīng)用HIF-1α抑制劑雷帕霉素后對(duì)其表達(dá)的影響，并進(jìn)一步探討KIM-1與HIF-1α、α-SMA的相互關(guān)系以及雷帕霉素對(duì)UUO大鼠的腎臟保護(hù)作用，為臨床防治慢性腎臟病的進(jìn)展提供實(shí)驗(yàn)性理論依據(jù)。
　　 方法:健康清潔級(jí)雄性SD大鼠72只，體重200±20g，隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組），模型組(UUO組)，治療組(Rap組)，每組24只。UUO

5、組和Rap組行左側(cè)輸尿管結(jié)扎并剪斷，建立UUO模型;Sham組僅游離左側(cè)輸尿管，但不結(jié)扎和剪斷。各組于手術(shù)前1天開(kāi)始給藥，根據(jù)體重調(diào)整藥量，Rap組以雷帕霉素2mg/kg/d灌胃，Sham組與UUO組以等容積生理鹽水灌胃，直至術(shù)后第14天。各組分別于術(shù)后1、4、7、14天隨機(jī)處死6只大鼠，取左側(cè)腎組織，一部分置于4％多聚甲醛中，用于HE染色觀察病理改變，免疫組化染色法檢測(cè)KIM-1、HIF-1α及α-SMA蛋白的表達(dá)，另一部分置于液氮中

6、快速冷凍，隨后轉(zhuǎn)至-80℃冰箱中保存，用于RT-PCR法檢測(cè)各因子的mRNA水平，然后分別采用圖像分析系統(tǒng)和凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:1、實(shí)驗(yàn)大鼠腎組織形態(tài)學(xué)變化
　　 Sham組大鼠兩側(cè)腎臟大小相當(dāng)，外觀無(wú)明顯差別;UUO組和Rap組梗阻側(cè)腎臟體積大于對(duì)側(cè)，且隨梗阻時(shí)間的延長(zhǎng)體積逐漸增大，可見(jiàn)腎實(shí)質(zhì)較對(duì)側(cè)明顯變薄，顏色

7、變淺，腎盂腎盞擴(kuò)張變形，腎內(nèi)積水，尤以術(shù)后14天最為顯著。光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)Sham組腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)均未見(jiàn)明顯異常，UUO組和Rap組術(shù)后1天腎組織病理改變不明顯，從術(shù)后4天病變較明顯，開(kāi)始出現(xiàn)腎小管擴(kuò)張，腎小管上皮細(xì)胞刷狀緣脫落，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腎間質(zhì)水腫，且隨著梗阻時(shí)間延長(zhǎng)，病變逐漸加重。與UUO組相比，Rap組大鼠腎組織病理學(xué)變化較輕。
　　 2、免疫組織化學(xué)結(jié)果
　　 KIM-1在Sham組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均無(wú)明顯表達(dá)，

8、在UUO組于術(shù)后1天表達(dá)即開(kāi)始增加，主要表達(dá)于近端腎小管上皮細(xì)胞，且隨著時(shí)間推移表達(dá)明顯升高，各時(shí)間點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;與同期UUO組相比，Rap組KIM-1表達(dá)均降低(P＜0.05)。HIF-1α在Sham組腎小管上皮細(xì)胞偶見(jiàn)表達(dá)，腎小球內(nèi)無(wú)陽(yáng)性表達(dá)，各時(shí)間點(diǎn)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;與同期Sham組相比，UUO組術(shù)后1天表達(dá)開(kāi)始增加，且隨著時(shí)間推移，表達(dá)呈上升趨勢(shì)，14天時(shí)表達(dá)最強(qiáng)，各時(shí)間點(diǎn)比較差異有

9、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與同期UUO組相比，Rap組HIF-1α表達(dá)均受到明顯抑制（P＜0.05）。α-SMA在Sham組腎間質(zhì)內(nèi)未見(jiàn)明顯表達(dá)，僅在腎小動(dòng)脈高表達(dá)，UUO組術(shù)后1天表達(dá)開(kāi)始增加，且隨著時(shí)間推移，表達(dá)明顯增高，除血管壁平滑肌細(xì)胞表達(dá)外，腎間質(zhì)和部分腎小管上皮細(xì)胞周?chē)斜磉_(dá)，各時(shí)間點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與同期UUO組相比，Rap組α-SMA表達(dá)均降低(P＜0.05)。
　　 3、RT-PCR結(jié)

10、果
　　 與同期Sham組相比，術(shù)后1、4、7、14天UUO組大鼠腎組織中KIM-1mRNA、HIF-1αmRNA、α-SMAmRNA表達(dá)均增加(P＜0.05)，而給予雷帕霉素干預(yù)后，與同時(shí)期UUO組相比，Rap組大鼠腎組織中KIM-1mRNA、HIF-1αmRNA、α-SMAmRNA表達(dá)均有所下降(P＜0.05)，但較Sham組表達(dá)明顯增高(P＜0.05)。
　　 4、相關(guān)性分析
　　 對(duì)KIM-1mRNA表達(dá)

11、水平與HIF-1α、α-SMAmRNA的表達(dá)情況進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，結(jié)果表明:KIM-1mRNA與HIF-1αmRNA的表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.874，P＜0.05);KIM-1mRNA與α-SMAmRNA的表達(dá)水平亦呈正相關(guān)(r=0.886，P＜0.05)。
　　 結(jié)論:在單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎組織中，HIF-1α、KIM-1和α-SMA表達(dá)均升高;使用雷帕霉素干預(yù)后，HIF-1α、KIM-1和α-SMA的表達(dá)下調(diào)，腎