ERK1-2在IgA腎病大鼠腎臟中的表達(dá)及雷帕霉素對(duì)其影響.pdf

1、目的:IgA腎?。↖gA nephropathy）是1968年由Berger和Hinglais首先提出，故又稱Berger病，其臨床表現(xiàn)以血尿最為常見(jiàn)。目前認(rèn)為IgA腎病在世界各地都是原發(fā)性腎小球腎炎中最常見(jiàn)的類型，在我國(guó)約占所有原發(fā)性腎小球疾病的26％～34％，研究發(fā)現(xiàn)，在確診后5～25年內(nèi)，約20％～40％的患者不可逆地進(jìn)展為終末期腎?。╡nd-stage renal disease，ESRD）。成人IgA腎病的病理特點(diǎn)多以系膜基質(zhì)

2、的沉積、新月體的形成和問(wèn)質(zhì)損害更為嚴(yán)重，兒童IgA腎病的病理改變則常以系膜細(xì)胞的增殖為主，小管及間質(zhì)病變較輕，即兒童臨床表現(xiàn)多為輕重不等的血尿和蛋白尿，成人則常伴有腎功能的損害。目前IgA腎病的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。大量文獻(xiàn)資料多根據(jù)IgA腎病系膜區(qū)存在免疫復(fù)合物沉積而從其免疫學(xué)方面闡述，根據(jù)其系膜細(xì)胞增殖這一病理學(xué)特點(diǎn)研究的文獻(xiàn)甚為少見(jiàn)。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated MAP kinase

3、，ERK）也稱為p42P44 MAPK，是目前最為活躍的研究領(lǐng)域，Ras-raf-MEK-ERK1/2是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族最為經(jīng)典的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一。當(dāng)ERK1/2受到刺激時(shí)，激活下游游特定的即早基因（immediate early genes，IEG），其基因產(chǎn)物引起細(xì)胞的生物學(xué)變化。已經(jīng)證明MAPK尤其是ERK1/2表達(dá)的改變高度影響系膜細(xì)胞的增殖，但

4、ERK1/2是否參與IgA腎病的發(fā)病目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立IgA腎病模型，并給予大鼠口服雷帕霉素建立對(duì)照，從分子生物學(xué)角度觀察ERK1/2在IgA腎病大鼠腎臟系膜細(xì)胞的表達(dá)，了解IgA腎病發(fā)病的特點(diǎn)，從而揭示其發(fā)病機(jī)制。大量文獻(xiàn)資料表明目前IgA腎病的治療多選用大劑量糖皮質(zhì)激素、魚油、ACEI、ARB類藥物和免疫抑制劑如環(huán)孢素A、環(huán)磷酰胺等水抑制免疫復(fù)合物的沉積，但尚尢統(tǒng)一的治療標(biāo)準(zhǔn)。雷帕霉素（rapamycin，RAP）是20

5、世紀(jì)70年代初，由加拿大Ayerst研究所從放線菌培養(yǎng)液中分離出來(lái)的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，20世紀(jì)70年代末期，Martal等首先發(fā)現(xiàn)其具有免疫抑制作用。業(yè)已證明雷帕霉素可通過(guò)不同的細(xì)胞因子受體陰斷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制系膜細(xì)胞的增生，干擾細(xì)胞周期蛋白產(chǎn)物的表達(dá)和細(xì)胞周期依賴性激酶，因?yàn)槔着撩顾夭粌H具有免疫抑制作用，還具有高效低毒的特點(diǎn)，故目前廣泛應(yīng)用于腫瘤，器官移植等治療，國(guó)內(nèi)外罕見(jiàn)雷帕霉素應(yīng)用于IgA腎病治療的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)多種實(shí)驗(yàn)方法了解雷

6、帕霉素對(duì)IgA腎病病理變化的影響，為揭示其分子生物學(xué)發(fā)病機(jī)制提供佐證，同時(shí)為臨床應(yīng)用新藥提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.功物與藥品
　　 Wistar雄性大鼠45只，體重80～100g，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)：702022）；雷帕霉素由華北制藥惠贈(zèng)；二步免疫組化試劑盒購(gòu)于北京中杉有限公司；其他實(shí)驗(yàn)藥品由河北醫(yī)科大學(xué)病理教研室提供。
　　 2.模型制備及實(shí)驗(yàn)分組
　

7、　 2.1 IgA腎病模型的制備：隔日給予大鼠牛血清白蛋白按400mg·kg-1·d-1的劑量灌胃，持續(xù)6周，皮下注射蓖麻油0.5ml和四氯化碳0.1ml，每周一次，持續(xù)9周，脂多糖0.05mg分別于第6、8周尾靜脈注射，觀察至10周末。將腎皮質(zhì)組織切成3μm的冰凍切片，采用兔抗大鼠IgA和FITC標(biāo)記羊抗兔IgG間接免疫熒光染色，熒光顯微鏡下觀察腎小球系膜區(qū)IgA沉積陽(yáng)性，PASM和Masson染色顯示系膜細(xì)胞增生和系膜基質(zhì)的沉積表

8、明造模成功（Fig.1），成功率為90％。未建模成功的大鼠由相同條件的大鼠以同樣方法建模直至成功。
　　 2.2實(shí)驗(yàn)分組
　　 Wistar雄性大鼠45只，體重80～100g，隨機(jī)分為對(duì)照組（15只）、IgA腎病組（15只）和雷帕霉素治療組（以下簡(jiǎn)稱RAP組，15只）。IgA腎病組大鼠按上述方法建立模型。將RAP組大鼠按同樣的方法成功建立IgA腎病模型后，繼續(xù)給予雷帕霉素1mg·kg-1·d-1灌胃，觀察至14周末。Ig

9、A腎病組大鼠在相同時(shí)間內(nèi)自由飲水、進(jìn)食。對(duì)照組在相同時(shí)間（14周內(nèi)）給予相同劑量的生理鹽水灌胃，觀察至14周末。
　　 3.各組大鼠生化指標(biāo)的檢測(cè)
　　 各組大鼠成功建立模型后準(zhǔn)備處死，處死前用代謝籠收集共24小時(shí)尿液，用自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)24小時(shí)尿蛋白；股動(dòng)脈放血應(yīng)用同樣的方法測(cè)定BUN、Scr，將數(shù)據(jù)收集進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 4.ERK1/2蛋白和cDNA的檢測(cè)
　　 4.1免疫組化法檢洲ERK1/

10、2蛋白在各組大鼠腎臟中的定位表達(dá)
　　 成功建模后取各組大鼠部分腎組織置于4％多聚甲醛固定，經(jīng)石蠟包理、切片。所用載玻片均經(jīng)多聚賴氨酸處理，邊續(xù)切片厚3μm，抗為兔抗ERK1/2多克隆抗體，二抗為PV9000二步法檢測(cè)試劑復(fù)合體，以0.01mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作陰性對(duì)照。采用PV9000通用二步法試劑盒檢測(cè)，光鏡觀察，陽(yáng)性部位呈棕黃色。設(shè)定陽(yáng)性比率，并行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
　　 4.2 Western bl

11、ot檢測(cè)大鼠腎組織ERK1/2蛋白的表達(dá)
　　 部分腎組織用眼科剪刀剪碎放入冰冷的研磨玻璃試管內(nèi)，加入冰冷的裂解緩沖液裂解腎皮質(zhì)，用研磨棒輕輕地研磨，冰浴靜置1h，然后4℃、14000r/min離心25min，上清液即為所提取的蛋白溶液。將所提取蛋白質(zhì)經(jīng)考馬斯亮藍(lán)定最，應(yīng)用 Western blot檢測(cè)腎組織ERK1/2蛋白的表達(dá)，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜后顯影，對(duì)Western條帶進(jìn)行分析。
　　 4.3半定量RT-PCR檢測(cè)腎組

12、織ERK1/2 cDNA的表達(dá)
　　 取各組大鼠部分腎組織，將其切割成大小約3×3mm的標(biāo)本，分裝，液氮中保存，每次實(shí)驗(yàn)取各組5個(gè)標(biāo)本，加入Trizol研磨，提取ERK1/2 mRNA，將其反轉(zhuǎn)錄并擴(kuò)增，統(tǒng)計(jì)cDNA的含量。
　　 結(jié)果:
　　 1.尿液及血清學(xué)結(jié)果顯示，IgA腎病組大鼠的24hUPO、BUN、Scr均高于RAP組（P<0.001）和對(duì)照組（P<0.05），同時(shí)RAP組大鼠的24hUPO、BUN、

13、Scr也高于對(duì)照組（P<0.05，Table.1）。
　　 2.免疫組化法檢測(cè)ERK1/2蛋白在大鼠腎臟組織的沉積結(jié)果顯示IgA腎病組較對(duì)照組（t=2.145，P<0.05）、RAP組（t=6.45，P<0.001）均明顯升高，同時(shí)RAP組中ERK1/2的表達(dá)也高于對(duì)照組（P<0.05，F(xiàn)ig.2，Table.2）。
　　 3.Western blot和半定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示IgA腎病組大鼠腎組織中ERK1/2蛋

14、白和cDNA的表達(dá)含量高于對(duì)照組（P<0.05）和RAP組（t=67.39，P<0.001），RAP組中ERK1/2蛋白和cDNA的表達(dá)含量同樣也高于對(duì)照組（t=2.45，P<0.05，F(xiàn)ig.3、4，Table.3、4）。
　　 結(jié)論:
　　 1.IgA腎病大鼠腎組織系膜細(xì)胞的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK1/2）表達(dá)明顯升高，同時(shí)RAP組大鼠腎組織中ERK1/2的表達(dá)亦較對(duì)照組明顯上調(diào)，表明多種因素可激活ERK1/2信號(hào)

15、轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，且可能由于該途徑的激活而參與了IgA腎病的發(fā)病過(guò)程。
　　 2.ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活使自身磷酸化，其蛋白及cDNA的表達(dá)增加，加入雷帕霉素治療后能夠明顯抑制IgA腎病大鼠腎組織中ERK1/2蛋白和cDNA的表達(dá)，提示雷帕霉素具有治療實(shí)驗(yàn)性IgA腎病大鼠的作用，但RAP組中ERK1/2的表達(dá)較對(duì)照組仍高，故是否能使大鼠IgA腎病得到徹底緩解尚需進(jìn)一步研究，同時(shí)需要反復(fù)實(shí)驗(yàn)找到雷帕霉素治愈IgA腎病的合適劑量。