ERK1-2在IgA腎病大鼠腎臟中的表達及雷帕霉素對其影響.pdf

1、目的:IgA腎?。↖gA nephropathy）是1968年由Berger和Hinglais首先提出，故又稱Berger病，其臨床表現以血尿最為常見。目前認為IgA腎病在世界各地都是原發(fā)性腎小球腎炎中最常見的類型，在我國約占所有原發(fā)性腎小球疾病的26％～34％，研究發(fā)現，在確診后5～25年內，約20％～40％的患者不可逆地進展為終末期腎病（end-stage renal disease，ESRD）。成人IgA腎病的病理特點多以系膜基質

2、的沉積、新月體的形成和問質損害更為嚴重，兒童IgA腎病的病理改變則常以系膜細胞的增殖為主，小管及間質病變較輕，即兒童臨床表現多為輕重不等的血尿和蛋白尿，成人則常伴有腎功能的損害。目前IgA腎病的發(fā)病機制尚不清楚。大量文獻資料多根據IgA腎病系膜區(qū)存在免疫復合物沉積而從其免疫學方面闡述，根據其系膜細胞增殖這一病理學特點研究的文獻甚為少見。細胞外信號調節(jié)激酶（extracellular signal-regulated MAP kinase

3、，ERK）也稱為p42P44 MAPK，是目前最為活躍的研究領域，Ras-raf-MEK-ERK1/2是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族最為經典的信號轉導通路之一。當ERK1/2受到刺激時，激活下游游特定的即早基因（immediate early genes，IEG），其基因產物引起細胞的生物學變化。已經證明MAPK尤其是ERK1/2表達的改變高度影響系膜細胞的增殖，但

4、ERK1/2是否參與IgA腎病的發(fā)病目前尚未見報道。本實驗通過建立IgA腎病模型，并給予大鼠口服雷帕霉素建立對照，從分子生物學角度觀察ERK1/2在IgA腎病大鼠腎臟系膜細胞的表達，了解IgA腎病發(fā)病的特點，從而揭示其發(fā)病機制。大量文獻資料表明目前IgA腎病的治療多選用大劑量糖皮質激素、魚油、ACEI、ARB類藥物和免疫抑制劑如環(huán)孢素A、環(huán)磷酰胺等水抑制免疫復合物的沉積，但尚尢統(tǒng)一的治療標準。雷帕霉素（rapamycin，RAP）是20

5、世紀70年代初，由加拿大Ayerst研究所從放線菌培養(yǎng)液中分離出來的大環(huán)內酯類抗生素，20世紀70年代末期，Martal等首先發(fā)現其具有免疫抑制作用。業(yè)已證明雷帕霉素可通過不同的細胞因子受體陰斷信號轉導，抑制系膜細胞的增生，干擾細胞周期蛋白產物的表達和細胞周期依賴性激酶，因為雷帕霉素不僅具有免疫抑制作用，還具有高效低毒的特點，故目前廣泛應用于腫瘤，器官移植等治療，國內外罕見雷帕霉素應用于IgA腎病治療的報道。本實驗通過多種實驗方法了解雷

6、帕霉素對IgA腎病病理變化的影響，為揭示其分子生物學發(fā)病機制提供佐證，同時為臨床應用新藥提供實驗室依據。
　　 方法:
　　 1.功物與藥品
　　 Wistar雄性大鼠45只，體重80～100g，由河北省實驗動物中心提供（實驗動物質量合格證編號：702022）；雷帕霉素由華北制藥惠贈；二步免疫組化試劑盒購于北京中杉有限公司；其他實驗藥品由河北醫(yī)科大學病理教研室提供。
　　 2.模型制備及實驗分組
　

7、　 2.1 IgA腎病模型的制備：隔日給予大鼠牛血清白蛋白按400mg·kg-1·d-1的劑量灌胃，持續(xù)6周，皮下注射蓖麻油0.5ml和四氯化碳0.1ml，每周一次，持續(xù)9周，脂多糖0.05mg分別于第6、8周尾靜脈注射，觀察至10周末。將腎皮質組織切成3μm的冰凍切片，采用兔抗大鼠IgA和FITC標記羊抗兔IgG間接免疫熒光染色，熒光顯微鏡下觀察腎小球系膜區(qū)IgA沉積陽性，PASM和Masson染色顯示系膜細胞增生和系膜基質的沉積表

8、明造模成功（Fig.1），成功率為90％。未建模成功的大鼠由相同條件的大鼠以同樣方法建模直至成功。
　　 2.2實驗分組
　　 Wistar雄性大鼠45只，體重80～100g，隨機分為對照組（15只）、IgA腎病組（15只）和雷帕霉素治療組（以下簡稱RAP組，15只）。IgA腎病組大鼠按上述方法建立模型。將RAP組大鼠按同樣的方法成功建立IgA腎病模型后，繼續(xù)給予雷帕霉素1mg·kg-1·d-1灌胃，觀察至14周末。Ig

9、A腎病組大鼠在相同時間內自由飲水、進食。對照組在相同時間（14周內）給予相同劑量的生理鹽水灌胃，觀察至14周末。
　　 3.各組大鼠生化指標的檢測
　　 各組大鼠成功建立模型后準備處死，處死前用代謝籠收集共24小時尿液，用自動生化分析儀檢測24小時尿蛋白；股動脈放血應用同樣的方法測定BUN、Scr，將數據收集進行統(tǒng)計學分析。
　　 4.ERK1/2蛋白和cDNA的檢測
　　 4.1免疫組化法檢洲ERK1/

10、2蛋白在各組大鼠腎臟中的定位表達
　　 成功建模后取各組大鼠部分腎組織置于4％多聚甲醛固定，經石蠟包理、切片。所用載玻片均經多聚賴氨酸處理，邊續(xù)切片厚3μm，抗為兔抗ERK1/2多克隆抗體，二抗為PV9000二步法檢測試劑復合體，以0.01mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作陰性對照。采用PV9000通用二步法試劑盒檢測，光鏡觀察，陽性部位呈棕黃色。設定陽性比率，并行統(tǒng)計學處理。
　　 4.2 Western bl

11、ot檢測大鼠腎組織ERK1/2蛋白的表達
　　 部分腎組織用眼科剪刀剪碎放入冰冷的研磨玻璃試管內，加入冰冷的裂解緩沖液裂解腎皮質，用研磨棒輕輕地研磨，冰浴靜置1h，然后4℃、14000r/min離心25min，上清液即為所提取的蛋白溶液。將所提取蛋白質經考馬斯亮藍定最，應用 Western blot檢測腎組織ERK1/2蛋白的表達，經電泳、轉膜后顯影，對Western條帶進行分析。
　　 4.3半定量RT-PCR檢測腎組

12、織ERK1/2 cDNA的表達
　　 取各組大鼠部分腎組織，將其切割成大小約3×3mm的標本，分裝，液氮中保存，每次實驗取各組5個標本，加入Trizol研磨，提取ERK1/2 mRNA，將其反轉錄并擴增，統(tǒng)計cDNA的含量。
　　 結果:
　　 1.尿液及血清學結果顯示，IgA腎病組大鼠的24hUPO、BUN、Scr均高于RAP組（P<0.001）和對照組（P<0.05），同時RAP組大鼠的24hUPO、BUN、

13、Scr也高于對照組（P<0.05，Table.1）。
　　 2.免疫組化法檢測ERK1/2蛋白在大鼠腎臟組織的沉積結果顯示IgA腎病組較對照組（t=2.145，P<0.05）、RAP組（t=6.45，P<0.001）均明顯升高，同時RAP組中ERK1/2的表達也高于對照組（P<0.05，Fig.2，Table.2）。
　　 3.Western blot和半定量RT-PCR檢測結果顯示IgA腎病組大鼠腎組織中ERK1/2蛋

14、白和cDNA的表達含量高于對照組（P<0.05）和RAP組（t=67.39，P<0.001），RAP組中ERK1/2蛋白和cDNA的表達含量同樣也高于對照組（t=2.45，P<0.05，Fig.3、4，Table.3、4）。
　　 結論:
　　 1.IgA腎病大鼠腎組織系膜細胞的細胞外信號調節(jié)激酶（ERK1/2）表達明顯升高，同時RAP組大鼠腎組織中ERK1/2的表達亦較對照組明顯上調，表明多種因素可激活ERK1/2信號

15、轉導途徑，且可能由于該途徑的激活而參與了IgA腎病的發(fā)病過程。
　　 2.ERK1/2信號轉導途徑激活使自身磷酸化，其蛋白及cDNA的表達增加，加入雷帕霉素治療后能夠明顯抑制IgA腎病大鼠腎組織中ERK1/2蛋白和cDNA的表達，提示雷帕霉素具有治療實驗性IgA腎病大鼠的作用，但RAP組中ERK1/2的表達較對照組仍高，故是否能使大鼠IgA腎病得到徹底緩解尚需進一步研究，同時需要反復實驗找到雷帕霉素治愈IgA腎病的合適劑量。