腺病毒介導(dǎo)TGF-β1轉(zhuǎn)基因聯(lián)合FTY720對(duì)大鼠同種異體心臟移植的影響.pdf

1、第一部分 目的：建立一種操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定可靠、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的同種異體異位心臟移植動(dòng)物模型。 方法：?jiǎn)稳瞬僮?。以雄性Wistar大鼠為供體，Sprague-Dawley大鼠為受體。麻醉后迅速摘取供心，備用；受體鼠肝素化，解剖出右側(cè)頸外靜脈及其分支，結(jié)扎并剪斷其分支。用微血管夾鉗夾近心端主干，近顱側(cè)結(jié)扎，距該線結(jié)約lmm縫一6-0Prolene線作牽引線，剪斷血管主干，牽引線引導(dǎo)頸外靜脈穿過(guò)Cuff管，用兩把顯微鑷將血管壁外翻在C

2、uff管外，5-0絲線環(huán)扎固定。類似方法處理右側(cè)頸總動(dòng)脈。供心于無(wú)名動(dòng)脈跟部前壁作一小切口，將頸總動(dòng)脈Cuff管插入其內(nèi)，環(huán)扎固定；同樣方法將頸外靜脈Cuff管插入肺動(dòng)脈內(nèi)并環(huán)扎固定。移去微血管夾先開(kāi)放頸外靜脈，再分次開(kāi)放頸總動(dòng)脈。 結(jié)果：全部移植成功，無(wú)吻合口漏血或回流受阻，2例右心耳出血，l例集束結(jié)扎處出血，均予結(jié)扎止血，全組無(wú)手術(shù)死亡，移植物復(fù)跳率100％?？偸中g(shù)時(shí)間45-60min，其中吻合時(shí)間僅3-8min。 結(jié)論

3、：該模型是一種實(shí)用、理想、易于復(fù)制的器官移植研究動(dòng)物模型。 第二部分 目的：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)是一種普遍存在、具有抗炎和免疫抑制活性的重要免疫調(diào)節(jié)因子，實(shí)驗(yàn)研究表明經(jīng)冠脈灌注TGF-β1轉(zhuǎn)基因治療可以減輕供心缺血一再灌注損傷、明顯延長(zhǎng)同種心臟移植物的存活時(shí)間；FTY720是一種新型強(qiáng)效的抗移植物排斥反應(yīng)藥物，研究表明可顯著延長(zhǎng)大鼠同種異體心臟移植的存活時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)在成功建立心臟移植模型的基礎(chǔ)上，通過(guò)冠脈T

4、GF-βl轉(zhuǎn)基因聯(lián)合應(yīng)用FTY720，觀察對(duì)大鼠移植心臟缺血一再灌注損傷的影響并探討其相關(guān)機(jī)制。 方法：利用Cuff技術(shù)建立頸部異位心臟移植模型，實(shí)驗(yàn)分為A、B、C、D、E共5組(n=6)：A組(空白對(duì)照組)：供心離體灌注4~CStanford大學(xué)停跳液；B組(空載體組)：供心離體灌注含5×109pfu／gm空白載體腺病毒顆粒的4。CStanford大學(xué)停跳液；C組(FTY720組)：受體鼠自術(shù)前3天開(kāi)始至術(shù)日每天管飼FTY72

5、0，劑量為3mg／kg，供心離體灌注4~CStanford大學(xué)停跳液；D組(轉(zhuǎn)基因組)：供心離體灌注含5×lo9pfu／gm攜帶mTGF-βl基因腺病毒顆粒的4~CStanford大學(xué)停跳液；E組(轉(zhuǎn)基因+FTY720組)：受體鼠自術(shù)前3天開(kāi)始至術(shù)日每天管飼FTY720，劑量為3mg／kg；供心離體灌注含5×109ppfu／gm攜帶mTGF-β1基因腺病毒顆粒的4~CStanford大學(xué)停跳液。于移植后8小時(shí)切取移植心臟，HE染色光鏡下

6、觀察移植物病理組織學(xué)變化，電鏡下觀察移植物心肌組織超微結(jié)構(gòu)變化；免疫組化染色檢測(cè)移植物mTGF-βl、ICAM-1、NF-KB表達(dá)情況；應(yīng)用一步法RT-PCR檢測(cè)心肌組織mTGF-β1mRNA的轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度；測(cè)定心肌組織中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性。單因素兩水平均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩因素兩水平均數(shù)比較采用析因設(shè)計(jì)方差分析(2×2析因分析)。 結(jié)果：移植后8小時(shí)，光鏡下見(jiàn)

7、C、D、E組心肌細(xì)胞腫脹減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少；電鏡下觀察見(jiàn)A、B組心肌線粒體水腫，部分呈空泡樣變，嵴紊亂，核周水腫，肌原纖維間水腫，部分肌絲斷裂，肌漿內(nèi)糖原顆粒明顯減少；C、D、E組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為完整，心肌間質(zhì)和血管周圍的中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞滲出明顯減少，心肌線粒體水腫明顯減輕，無(wú)明顯的肌絲斷裂現(xiàn)象。免疫組化染色證實(shí)mTGF—Bl成功轉(zhuǎn)到心肌細(xì)胞，mTGF-β1表達(dá)強(qiáng)度D、E兩組明顯高于其它三組(P<0．01)；D、E組ICAM．1

8、及NF-Kb的表達(dá)較A、B、C三組顯著下調(diào)(P<0．01)；TUNEL法檢測(cè)移植物組織心肌細(xì)胞凋亡示D、E兩組心肌細(xì)胞凋亡顯著減少(P<0．01)；RT-PCR證實(shí)D、E兩組移植心臟有外源性mTGF-βl基因轉(zhuǎn)錄；與A、B組比較，C、D、E組SOD活性明顯升高(P<0．01)；MDA含量和MPO活性明顯下降(P<0．01)，轉(zhuǎn)基因因素和FTY720因素對(duì)SOD、MDA和MPO的影響存在交互作用(P<0．05)。 結(jié)論：TGF-β

9、1和FTY720均具有減輕移植心臟缺血．再灌注損傷的作用，機(jī)制可能與抑制心肌細(xì)胞凋亡、下調(diào)ICAM-1、NF-KB表達(dá)、增高SOD活性等因素有關(guān)；二者聯(lián)合應(yīng)用在減輕缺血．再灌注損傷方面有協(xié)同作用。 第三部分 目的：通過(guò)經(jīng)冠脈TGF-β1轉(zhuǎn)基因聯(lián)合應(yīng)用FTY720，觀察兩者對(duì)大鼠移植心臟急性排斥反應(yīng)的影響并探討其相關(guān)機(jī)制。 方法：利用Cuff技術(shù)建立頸部異位心臟移植模型。60只清潔級(jí)雄性Wistar大鼠作供體，隨機(jī)

10、分成5組，每組12只60只清潔級(jí)雄性SD大鼠作受體，隨機(jī)分成5組，每組12只。分別為F組(空白對(duì)照組)：供心離體灌注4~CStanford大學(xué)停跳液；G組(空載體組)：供心離體灌注含5x109pfu／gm空白載體腺病毒顆粒的4~CStanford大學(xué)停跳液；H組(FTY720組)：受體鼠自術(shù)前3天開(kāi)始至術(shù)后第¨天每天管飼FTY720，劑量為3mg／kg，供心離體灌注4~CStanford大學(xué)停跳液；I組(轉(zhuǎn)基因組)：供心離體灌注含5×l

11、o9pfu／gm攜帶mTGF-β1基因腺病毒顆粒的4~CStanford大學(xué)停跳液；J組(轉(zhuǎn)基因+FTY720組)：受體鼠自術(shù)前3天開(kāi)始至術(shù)后第U天每天管飼FTY720，劑量為3mg／kg；供心離體灌注含5×lO9pfu／gm攜帶mTGF-β1基因腺病毒顆粒的4~CStanford大學(xué)停跳液。各組均于術(shù)后第5天隨機(jī)選6只動(dòng)物抽取外周血后留取標(biāo)本，每組剩余6只觀察存活期。HE染色光鏡下觀察排斥反應(yīng)級(jí)別；免疫組化染色檢測(cè)移植物mTGF-β1

12、、Bcl-2、Bax表達(dá)情況；應(yīng)用一步法RT-PCR檢測(cè)心肌組織mTGF-β1mRNA轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度；WesternBlotting檢測(cè)mTGF-β1蛋白水平；應(yīng)用流式細(xì)胞儀行外周血CD3+/CD4+T淋巴細(xì)胞和CD3+/CD8+T淋巴細(xì)胞檢測(cè)。單因素多組間均數(shù)比較采用f檢驗(yàn)或One-WayANOVA方差分析，兩因素兩水平均數(shù)比較采用析因設(shè)計(jì)方差分析(2×2析因分析)。 結(jié)果：H、I、J組存活時(shí)間較F、G兩組明顯延長(zhǎng)(P

13、其中J組最長(zhǎng)，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

14、。H、I、J三組術(shù)后5天心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯降低(P<0．01)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞亞型，發(fā)現(xiàn)H、J兩組與另外三組比較，CD3+/CD4+T淋巴細(xì)胞和CD3+/CD8+T淋巴細(xì)胞顯著減少，其中CD3+／CD4+T淋巴細(xì)胞減少更明顯。轉(zhuǎn)基因因素和FTY720因素在以上統(tǒng)計(jì)處理析因分析中均存在交互作用(P<0．05)。 結(jié)論：經(jīng)冠脈TGF-βl轉(zhuǎn)基因聯(lián)合FTY720在減輕大鼠同種異體心臟移植急性排斥反應(yīng)方面有協(xié)同作用，移植