p21waf1-cip1在錳誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性中的作用及調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、錳是一種常見的環(huán)境和職業(yè)污染物，可通過呼吸道、消化道等多種途徑進(jìn)入人體蓄積并產(chǎn)生不良作用。因此，錳對(duì)人體的影響正日益受到重視。錳神經(jīng)毒性的主要病變部位位于蒼白球、尾狀核、殼核和黑質(zhì)，在臨床上主要表現(xiàn)為錐體外系神經(jīng)受損癥狀，這可能與錳選擇性的蓄積部位有關(guān)。研究證明，腦代謝異常和多巴胺能神經(jīng)元損傷可能是錳中毒導(dǎo)致震顫性麻痹的主要原因。盡管國內(nèi)外已進(jìn)行了一系列研究，但錳神經(jīng)毒性的確切機(jī)制仍不清楚。
　　我們近來的研究發(fā)現(xiàn)，錳中毒除了可引

2、起多巴胺能神經(jīng)元損傷，還可使大鼠黑質(zhì)紋狀體和多巴胺能的PC12細(xì)胞p21表達(dá)明顯升高。p21作為細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制因子，是CIP家族的一員，它可直接與CDK1、CDK2、CDK4和cyclinA、B、D、E共同參與形成具有酶活性的復(fù)合物，發(fā)揮細(xì)胞周期調(diào)節(jié)功能。越來越多的研究證實(shí)，p21不僅僅是在細(xì)胞分裂中發(fā)揮功能，p21還可通過p53依賴或p53非依賴途徑在細(xì)胞死亡中起到重要的調(diào)節(jié)作用。還有研究證實(shí)細(xì)胞生長異常以及細(xì)胞增殖調(diào)控機(jī)制

3、與神經(jīng)退行性變密切相關(guān)，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)可能參與了多種慢性神經(jīng)變性疾病的發(fā)病機(jī)制。此外關(guān)于神經(jīng)細(xì)胞的研究也證實(shí)了細(xì)胞周期蛋白在神經(jīng)元凋亡中的作用。
　　目的：
　　通過建立錳中毒的動(dòng)物和細(xì)胞模型，觀察錳對(duì)p21表達(dá)的影響，并進(jìn)一步通過體外實(shí)驗(yàn)探討p21在錳誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性中的作用及表達(dá)調(diào)控機(jī)制，從而為進(jìn)一步闡明錳的神經(jīng)毒性作用提供新的思路和理論依據(jù)。
　　方法：
　　1．使用腦立體定位注射方法建立錳中毒的動(dòng)物

4、模型，采用免疫熒光染色、westernblot和RT-PCR檢測(cè)多巴胺能神經(jīng)元的損傷和p21表達(dá)的改變；
　　2．利用PC12細(xì)胞建立錳中毒的細(xì)胞模型，MTT、臺(tái)盼藍(lán)染色、流式細(xì)胞術(shù)等檢測(cè)細(xì)胞毒性；
　　3．Westernblot、免疫熒光染色和siRNA轉(zhuǎn)染等檢測(cè)p21在錳誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性中的作用；
　　4．Westernblot、RT-PCR、熒光素酶報(bào)告基因等方法檢測(cè)錳對(duì)p21的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。
　　結(jié)果：

5、r>　　1．錳對(duì)大鼠多巴胺能神經(jīng)元損傷和p21表達(dá)的影響
　　通過腦立體定位注射方法建立大鼠錳中毒的動(dòng)物模型；免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)染錳后可造成大鼠黑質(zhì)部位TH免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)目明顯減少，RT-PCR和westernblot結(jié)果證實(shí)在多巴胺能神經(jīng)元損傷的同時(shí)，伴隨著p21mRNA和蛋白水平明顯升高。
　　2．p21在錳誘導(dǎo)的多巴胺能PC12細(xì)胞損傷中的作用
　　MTT和臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果顯示，染錳后可造成PC12細(xì)胞活力明顯減

6、弱，且呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴的趨勢(shì)；流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，錳染毒后PC12細(xì)胞的增殖受到抑制，細(xì)胞周期發(fā)生阻滯；RT-PCR和westernblot結(jié)果發(fā)現(xiàn)錳可引起PC12細(xì)胞p21mRNA和蛋白水平升高，而對(duì)其它相關(guān)分子表達(dá)沒有明顯改變；免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)染錳后p21有向核聚集的趨勢(shì)；p21siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)一步證實(shí)了p21在錳誘導(dǎo)的細(xì)胞生長和增殖中的作用，說明p21蛋白轉(zhuǎn)位和表達(dá)改變可能參與了錳誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性過程。
　　3．錳誘導(dǎo)的PC

7、12細(xì)胞p21蛋白表達(dá)的調(diào)控機(jī)制
　　通過CHX預(yù)處理，我們發(fā)現(xiàn)錳誘導(dǎo)p21表達(dá)主要通過轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)；熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示，錳可使p21啟動(dòng)子活性增強(qiáng)，從轉(zhuǎn)錄起始水平增加p21的轉(zhuǎn)錄；錳并不影響PC12細(xì)胞p21mRNA和蛋白水平的穩(wěn)定性體內(nèi)體外模型westernblot結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，錳可使DNA損傷標(biāo)記物p-H2AX和p53水平升高，但p21是否通過p53依賴方式被激活還有待進(jìn)一步研究
　　結(jié)論：
　　本研究首先通

8、過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)錳可造成大鼠多巴胺能神經(jīng)元損傷和p21表達(dá)增加；體外研究也證實(shí)錳對(duì)多巴胺能的PC12細(xì)胞具有明顯的毒性作用，而p21在細(xì)胞中異常表達(dá)可能是錳對(duì)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用的重要機(jī)制之一；隨后從轉(zhuǎn)錄和翻譯后水平探討錳對(duì)p21蛋白表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，發(fā)現(xiàn)錳可通過激活p21啟動(dòng)子，從轉(zhuǎn)錄起始水平調(diào)控p21蛋白的表達(dá)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)錳并不影響PC12細(xì)胞p21mRNA和蛋白的穩(wěn)定性；此外，體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)，錳還可引起DNA損傷和p53蛋