NEDD9在肝癌中的表達(dá)及其與肝癌細(xì)胞生物學(xué)特性之間關(guān)系的研究.pdf

1、背景：原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌（HCC）的發(fā)病率逐年上升，目前，在世界范圍內(nèi)，它已經(jīng)是處于第二位的癌癥致死原因，每年大約有800000的肝癌患者死亡。肝癌的根治性治療手段包括根治性肝癌切除、肝臟移植和經(jīng)皮肝癌射頻消融術(shù)，除此之外的選擇性肝動脈栓塞化療（TACE）、放射性栓塞以及系統(tǒng)的全身化療都是姑息性治療手段。在臨床工作中，醫(yī)務(wù)工作者們往往根據(jù)患者的腫瘤特征、腫瘤分期以及患者身體狀況采取個性化的治療方案。其中只有早期肝癌患者適合采取根治性治療手

2、段，其5年生存率也相應(yīng)較高，能夠達(dá)到75％。通常來說，當(dāng)有癥狀時發(fā)現(xiàn)的肝癌往往已經(jīng)有了沿脈管系統(tǒng)的侵犯或者腫瘤體積過大，15%的肝癌患者診斷時已經(jīng)有了肝外轉(zhuǎn)移，最常見的轉(zhuǎn)移器官包括肺臟、腹腔淋巴結(jié)、骨和腎上腺，這些患者只能采取姑息性治療手段。但是無論是早期肝癌患者還是晚期肝癌患者，困擾臨床醫(yī)生的一個問題是患者在治療過程中或治療后不久就出現(xiàn)了肝內(nèi)或者其它遠(yuǎn)處臟器的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。既往的研究已經(jīng)表明，肝癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是一個包含多個關(guān)鍵分子、多條

3、信號通路的多步驟生物學(xué)過程，在此過程中，腫瘤細(xì)胞會經(jīng)歷一個多基因的變化過程，從而導(dǎo)致其增殖潛能增加，凋亡耐受以及轉(zhuǎn)移能力的增強。因此，探索尋找與肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)的關(guān)鍵敏感基因，從而揭示這個過程的深層次機(jī)制，對于改善肝癌的治療和預(yù)后有著重要意義。
　　NEDD9的英文完整名稱是 Neural precursor cell Expressed Developmentally Down regulated9，在一些文獻(xiàn)里還被描述為HEF

4、1（Human enhancer of filamentation1），另外還有一種形式是 Cas-L，它的 mRNA包含2505nt。很多研究都已經(jīng)把NEDD9基因定位于一個能夠決定腫瘤轉(zhuǎn)移的“開關(guān)”。在轉(zhuǎn)移性乳腺癌中，有一系列的異常表達(dá)基因可以作為特征性表現(xiàn)，而NEDD9正是其中一員。在高侵襲的膠質(zhì)瘤中，NEDD9是前致癌基因 FAK激酶的特異性效應(yīng)分子，對于腫瘤細(xì)胞的遷徙和侵襲至關(guān)重要，利用轉(zhuǎn)基因的手段下調(diào)NEDD9的表達(dá)水平能夠

5、削弱此種細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。通過飽和性比較基因雜交的方法，在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的大基因組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，NEDD9在一個小鼠轉(zhuǎn)移性黑色素瘤動物模型中是一個擴(kuò)增子的目標(biāo)基因，而這個擴(kuò)增子與腫瘤的轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。相似的研究證實在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤中，NEDD9無論是在mRNA還是蛋白水平其表達(dá)量均明顯升高，即便是在沒有基因擴(kuò)增的情況下依然如此，而且這種表達(dá)量的升高與腫瘤轉(zhuǎn)移過程密切相關(guān)?？偟脕碚f，NEDD9在細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、生長和致癌性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮著十分重要的作

6、用。然而 NEDD9也可能在不同腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)過程中發(fā)揮著不同的作用，典型的例子就是在一個發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的乳腺癌細(xì)胞系中 NEDD9的表達(dá)低于正常水平，這個研究被報道在《自然》雜志。雖然NEDD9在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的作用是一個近期的研究熱點，但NEDD9在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中的作用及其調(diào)控的相關(guān)分子網(wǎng)絡(luò)尚未見文獻(xiàn)報道。
　　目的：檢測 NEDD9在肝癌組織中及癌旁非腫瘤肝臟組織中的表達(dá)差異，探討NEDD9的表達(dá)與肝細(xì)胞癌一系列臨床指標(biāo)及

7、預(yù)后的關(guān)系；利用基因轉(zhuǎn)染、RNA干擾等技術(shù)從體內(nèi)、外觀察上調(diào)和下調(diào)NEDD9的表達(dá)水平對肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等細(xì)胞學(xué)特性的作用，評價其作為肝癌基因治療靶點的意義；探討NEDD9介導(dǎo)肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的可能機(jī)制。
　　方法：通過RT-qPCR和Western blot的方法檢測肝癌組織和癌旁非腫瘤組織中NEDD9 mRNA和蛋白水平的表達(dá)；用免疫組織化學(xué)染色的手段研究肝癌組織中NEDD9的表達(dá)水平和常見臨床指標(biāo)之間的關(guān)系；

8、NEDD9對肝癌復(fù)發(fā)和生存預(yù)后的意義通過采用生存分析的研究方法予以說明；通過基因重組的方法改變肝癌細(xì)胞中NEDD9的表達(dá)水平，并通過MTT、平板克隆形成實驗、劃痕修復(fù)實驗以及Transwell小室穿膜實驗分別分析NEDD9在體外對肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。通過小鼠動物模型研究NEDD9在體內(nèi)對肝癌細(xì)胞增殖、侵襲以及轉(zhuǎn)移能力的作用。末尾研究了NEDD9通過何種分子機(jī)制促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、遷移以及侵襲。
　　結(jié)果：
　　

9、1、第一部分實驗結(jié)果證明肝癌組織中NEDD9的mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯高于相應(yīng)的癌旁非腫瘤肝臟組織，此外NEDD9的表達(dá)量與腫瘤大小、腫瘤病理分化程度、有無其它臟器轉(zhuǎn)移、有無門靜脈侵犯以及腫瘤的TNM分期有關(guān)。生存分析顯示，NEDD9高表達(dá)的肝癌患者的術(shù)后無瘤生存時間以及總生存時間均明顯短于 NEDD9低表達(dá)的肝癌患者。NEDD9的表達(dá)水平可以作為一個獨立的肝癌預(yù)后指標(biāo)，甚至包括一些臨床上難以判斷復(fù)發(fā)和預(yù)后的肝癌亞組。
　　2、

10、第二部分體外實驗發(fā)現(xiàn)，肝癌細(xì)胞系中NEDD9 mRNA表達(dá)水平均明顯高于正常肝臟細(xì)胞系，肝癌細(xì)胞系的NEDD9蛋白表達(dá)水平顯著高于正常肝臟細(xì)胞系。肝癌細(xì)胞相比較正常肝臟細(xì)胞表現(xiàn)出了較強的增殖、遷移及侵襲能力，這種增殖、遷移以及侵襲能力的差異與其 NEDD9 mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)差異有著類似的趨勢。通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方法穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MHCC-97H以及Huh7細(xì)胞，分別上調(diào)和下調(diào)了兩種肝癌細(xì)胞中NEDD9的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過轉(zhuǎn)染上調(diào)NED

11、D9基因表達(dá)后的兩種肝癌細(xì)胞的增殖、運動遷移以及侵襲能力都明顯增強，而轉(zhuǎn)染下調(diào)NEDD9基因表達(dá)后的兩種肝癌細(xì)胞的增殖、運動遷移和侵襲能力明顯減弱。體內(nèi)實驗中裸鼠皮下移植瘤成瘤實驗結(jié)果顯示，MHCC-97H肝癌細(xì)胞本身具有一定的成瘤能力，下調(diào)NEDD9表達(dá)后的 MHCC-97H細(xì)胞的裸鼠皮下移植瘤成瘤能力則明顯弱于對照組MHCC-97H細(xì)胞，腫瘤體積明顯較小。裸鼠肝癌肺轉(zhuǎn)移實驗發(fā)現(xiàn)表達(dá)正常水平NEDD9的MHCC-97H肝癌細(xì)胞有一定的

12、幾率形成肝癌肺轉(zhuǎn)移，下調(diào)NEDD9表達(dá)水平后的MHCC-97H肝癌細(xì)胞基本不會造成裸鼠肝癌肺轉(zhuǎn)移。
　　3、第三部分實驗結(jié)果證明NEDD9可能通過調(diào)控Fascin蛋白的表達(dá)及其結(jié)構(gòu)的重組改變肝癌細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，從而促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲。上調(diào)肝癌細(xì)胞中NEDD9的表達(dá)后，轉(zhuǎn)錄因子 Snail、Slug的表達(dá)水平亦會隨之上調(diào)，而 E-cadherin的表達(dá)水平會隨之下調(diào)；下調(diào)NEDD9的表達(dá)后，轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug的表達(dá)水

13、平亦會隨之下調(diào)，而E-cadherin的表達(dá)水平會隨之上調(diào)。在肝癌細(xì)胞中上調(diào)NEDD9的表達(dá)后，金屬蛋白酶MMP-2以及 MMP-9的表達(dá)水平亦會隨之上調(diào)；下調(diào) NEDD9的表達(dá)后，金屬蛋白酶MMP-2以及MMP-9的表達(dá)水平亦會隨之下調(diào)。
　　結(jié)論：NEDD9在肝癌組織中的表達(dá)水平明顯升高，NEDD9的表達(dá)水平與腫瘤大小、腫瘤病理分化程度、有無其它臟器轉(zhuǎn)移、有無門靜脈侵犯以及腫瘤的TNM分期有關(guān)。NEDD9可以預(yù)測肝癌的復(fù)發(fā)及生