1、NEDD9在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用研究;2、肝癌單鏈抗體的可溶性表達(dá)及活性鑒定.pdf

1、一、NEDD9在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用研究
　　肝癌是我國(guó)常見(jiàn)的一種惡性腫瘤，其惡性程度高，容易發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。大部分肝癌患者都是死于腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，然而對(duì)于肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移目前治療手段有限。這就迫使科研工作者和臨床醫(yī)師不斷努力尋找肝癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因改變，以期闡明肝癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的機(jī)制，試圖從根本上攻克肝癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。
　　研究目的：檢測(cè)肝癌標(biāo)本及肝癌細(xì)胞系中NEDD9的表達(dá)情況，分析其表達(dá)與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系，利用RNA干擾

2、技術(shù)下調(diào)肝癌細(xì)胞系中NEDD9的表達(dá)，降低NEDD9的表達(dá)后觀察肝癌細(xì)胞體外遷移、侵襲能力及增殖能力的變化。
　　研究方法：
　　1、收集有及無(wú)轉(zhuǎn)移發(fā)生的肝癌標(biāo)本，利用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)肝癌標(biāo)本中NEDD9的表達(dá)。
　　2、提取細(xì)胞總RNA利用RT-PCR的方法檢測(cè)肝癌細(xì)胞系及永生化的正常肝細(xì)胞中NEDD9的表達(dá)情況。
　　3、選擇干擾靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成寡核苷酸鏈，體外退火后將其克隆入干擾表達(dá)載體pSilence

3、r3.1中，構(gòu)建針對(duì)NEDD9特異性的shRNA表達(dá)載體，利用構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系MHCC97，通過(guò)RT-PCR、Western-blot及間接免疫熒光分別檢測(cè)NEDD9在mRNA水平和蛋白水平的變化。
　　4、下調(diào)肝癌細(xì)胞系中NEDD9的表達(dá)后，利用劃痕實(shí)驗(yàn)及體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝癌細(xì)胞體外遷移能力和侵襲能力的變化。
　　5、通過(guò)MTT檢測(cè)下調(diào)NEDD9的表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖能力的影響。
　　6、利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)下調(diào)

4、NEDD9的表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞周期的影響。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1、免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示NEDD9在大部分肝癌組織中均有表達(dá)，在有轉(zhuǎn)移的肝癌組織中NEDD9的表達(dá)量及陽(yáng)性率均較無(wú)轉(zhuǎn)移的肝癌組織高。
　　2、NEDD9在肝癌細(xì)胞系中表達(dá)增高。我們利用RT-PCR的方法檢測(cè)了三種肝癌細(xì)胞系MHCC97、HepG2、Huh7及永生化的正常肝細(xì)胞QZG中NEDD9的表達(dá)，結(jié)果顯示與正常肝細(xì)胞相比，三種肝癌細(xì)胞系中均有NEDD9的高

5、表達(dá)，高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞系MHCC97中表達(dá)量較高。
　　3、成功構(gòu)建了針對(duì)NEDD9的shRNA表達(dá)載體。將所構(gòu)建的shRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系MHCC97，發(fā)現(xiàn)其能明顯降低肝癌細(xì)胞中NEDD9的表達(dá)，無(wú)論是在mRNA水平還是在蛋白水平。
　　4、減低肝癌細(xì)胞系MHCC97中NEDD9的表達(dá)可以抑制肝癌細(xì)胞體外遷移和侵襲的能力。針對(duì)NEDD9的shRNA轉(zhuǎn)染會(huì)導(dǎo)致MHCC97細(xì)胞體外遷移能力的降低及侵襲能力下降。
　

6、　5、降低肝癌細(xì)胞系MHCC97中NEDD9的表達(dá)可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖及出現(xiàn)細(xì)胞周期的S期阻滯。MHCC97細(xì)胞轉(zhuǎn)染NEDD9特異性的shRNA后，通過(guò)MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞的增殖能力受到了明顯的抑制；利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)處于細(xì)胞周期S期的細(xì)胞數(shù)減少，出現(xiàn)了S期阻滯。
　　結(jié)論：本研究提示NEDD9在有轉(zhuǎn)移的肝癌標(biāo)本中及高轉(zhuǎn)移的肝癌細(xì)胞系中高表達(dá)，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)表明其在肝癌的遷移和侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用，是一個(gè)與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移相

7、關(guān)的分子，有望成為一個(gè)抗肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移的治療靶點(diǎn)或肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)指標(biāo)。
　　二、肝癌單鏈抗體的可溶性表達(dá)及活性鑒定
　　腫瘤特異性單鏈抗體在腫瘤的診斷和治療中有著良好的應(yīng)用前景。我們實(shí)驗(yàn)室利用噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)，構(gòu)建了全人源肝癌單鏈抗體噬菌體庫(kù)，從中篩選到了一株肝癌特異性單鏈抗體，并在體外進(jìn)行了原核表達(dá)，但是表達(dá)出的單鏈抗體主要是以包涵體形式存在，需要經(jīng)過(guò)復(fù)雜的復(fù)性過(guò)程才能夠得到有活性的目的蛋白。
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簶?gòu)建

8、肝癌單鏈抗體的可溶性原核表達(dá)系統(tǒng)，并鑒定其生物學(xué)活性，為其下一步應(yīng)用研究打下基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗(yàn)方法：將所篩選出來(lái)的單鏈抗體基因克隆入原核表達(dá)載體pET-32a中，利用pET-32a表達(dá)出來(lái)的硫氧環(huán)蛋白增加目的蛋白的可溶性。將所構(gòu)建的重組載體克隆入大腸桿菌BL21表達(dá)菌中。利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)后通過(guò)SDS-PAGE分析目的蛋白表達(dá)情況。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni-NTA純化后，利用細(xì)胞ELISA和間接免疫熒光等分析其活性。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)

9、果：經(jīng)酶切鑒定，證實(shí)目的基因scFv-D25正確克隆入pET-32a中，成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-32a/scFv-D25。在大腸桿菌BL21中實(shí)現(xiàn)了scFv-D25的可溶性表達(dá)。經(jīng)Ni-NTA純化后得到了高純度的純化產(chǎn)物。通過(guò)細(xì)胞ELISA及間接免疫熒光分析證實(shí)所得的scFv-D25具有與肝癌結(jié)合的特異性。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建了肝癌單鏈抗體的pET-32a表達(dá)載體，并在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物主要以可溶性形式存在。經(jīng)N