NEDD9分子在肝癌細胞增殖遷移中的作用研究.pdf

1、研究背景:原發(fā)性肝癌是一種全球高發(fā)、惡性程度很高、易轉(zhuǎn)移復發(fā)的惡性腫瘤。復發(fā)和轉(zhuǎn)移是造成大部分肝癌患者死亡的原因。目前仍無特效的診斷與治療肝癌的手段。究其原因在于對肝癌的發(fā)生與發(fā)展機制的認識不足。與其它腫瘤相似，肝癌的發(fā)生與發(fā)展的分子機制十分復雜，除了可能的外部因素外，內(nèi)部基因的表達與調(diào)控對其發(fā)生起著決定性作用。除了基因本身的突變，一系列調(diào)控因素諸如表觀遺傳學調(diào)節(jié)也能影響到目的基因的表達。NEDD9是一個與發(fā)育相關(guān)的基因，在細胞的增殖與

2、發(fā)育中起著重要作用。但是具體作用機制目前不明，尤其是在原發(fā)性肝癌中的作用亟需研究。
　　研究目的:在肝癌細胞系SMMC-7721細胞中利用過表達NEDD9、合成shRNA抑制NEDD9的表達，使之形成NEDD9的過表達和低表達的表型，觀察轉(zhuǎn)染后的肝癌細胞系SMMC-7721細胞體外遷移和增殖能力的變化。利用E.coli表達NEDD9與GST的融合表達蛋白，以體外的pull-down試驗，獲取與NEDD9相互作用的蛋白，以質(zhì)譜鑒定。

3、
　　研究方法:1.提取肝癌細胞系SMMC-7721細胞總RNA，利用RT-PCR的方法檢測NEDD9的mRNA表達。
　　2.利用IPTG誘導表達NEDD9及幾段功能結(jié)構(gòu)域（N甲、N乙）在原核細胞中蛋白的表達，期望純化蛋白做深入研究。
　　3.構(gòu)建NEDD9的真核表達質(zhì)粒，并基于軟件選擇NEDD9的干擾位點，設計合成shRNA，分別轉(zhuǎn)染肝癌細胞系SMMC-7721細胞，觀察轉(zhuǎn)染后的肝癌細胞體外遷移和增殖能力的改變。<

4、br>　　4.利用劃痕實驗檢測轉(zhuǎn)染的NEDD9過表達和低表達肝癌細胞體外遷移能力的改變。
　　5.通過細胞計數(shù)法檢測轉(zhuǎn)染的NEDD9過表達和低表達肝癌細胞增殖能力的改變。
　　6.通過MTS法檢測轉(zhuǎn)染的NEDD9過表達和低表達肝癌細胞凋亡的改變。
　　實驗結(jié)果:1.利用RT-PCR的方法檢測了肝癌細胞系SMMC-7721中NEDD9的表達，結(jié)果顯示NEDD9在肝癌細胞系中表達。
　　2.成功構(gòu)建了NEDD9在pc

5、DNA3.1中的過表達載體，并轉(zhuǎn)染肝癌細胞系SMMC-7721細胞，利用RT-PCR的方法檢測到NEDD9在SMMC-7721細胞中過表達。
　　3.將合成的shRNA轉(zhuǎn)染肝癌細胞系SMMC-7721細胞，利用RT-PCR的方法檢測其在mRNA水平的變化，發(fā)現(xiàn)其能明顯降低肝癌細胞中NEDD9的表達。
　　4.在肝癌細胞系SMMC-7721細胞中，抑制NEDD9的表達，可抑制細胞的體外遷移能力。合成的shRNA轉(zhuǎn)染肝癌細胞系，

6、檢測到細胞的遷移能力降低。
　　5.抑制肝癌細胞系SMMC-7721中NEDD9的表達可以減緩肝癌細胞的增殖。同上，過表達載體轉(zhuǎn)染SMMC-7721細胞后，首先鑒定NEDD9的表達水平升高程度，然后利用活細胞計數(shù)法發(fā)現(xiàn)肝癌細胞的增殖能力增強。
　　6.確定NEDD9的表達水平抑制后，利用MTS試驗檢測到細胞的凋亡增強。
　　結(jié)論:本研究提示NEDD9在肝癌細胞系中表達，抑制NEDD9的表達可降低SMMC-7721細胞的