NEDD9在胃癌中的表達(dá)及其siRNA對(duì)胃癌NEDD9基因表達(dá)影響的體內(nèi)外研究.pdf

1、背景:胃癌是世界上常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一,具有發(fā)病率高、發(fā)病隱匿、易轉(zhuǎn)移和死亡率高等特點(diǎn)。我國(guó)是胃癌的高發(fā)區(qū),目前胃癌的發(fā)病率和死亡率分別位居惡性腫瘤的第二、第三位。近年來(lái),隨著手術(shù)切除、放射治療、化學(xué)治療及其它綜合性治療措施的應(yīng)用,胃癌在治療效果方面雖然有了一定程度的進(jìn)展,但總體來(lái)說(shuō)并不十分理想。因此,進(jìn)一步探討胃癌的發(fā)病機(jī)制,尋求更有效的治療手段是當(dāng)前臨床研究的熱點(diǎn)課題之一。
　　 NEDD9(Neural precurs

2、or cell Expressed Developmentally Down-regulated9,NEDD9)屬于接頭分子CAS(Crk-associated substrate)家族成員之一,是一種重要的細(xì)胞骨架蛋白,在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中起到承上啟下的作用,從而調(diào)節(jié)許多調(diào)控蛋白的表達(dá)和活化。研究發(fā)現(xiàn),NEDD9在細(xì)胞的增殖、凋亡、粘附、遷徙及侵襲等生物學(xué)特性方面發(fā)揮著重要作用。在多種腫瘤中NEDD9的過(guò)度表達(dá),可使腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、侵襲、

3、凋亡以及細(xì)胞周期等生物學(xué)特性發(fā)生改變。然而對(duì)NEDD9在胃癌中所發(fā)揮作用的研究在國(guó)內(nèi)外尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。NEDD9和胃癌的發(fā)生發(fā)展是否有相關(guān)性,抑制NEDD9表達(dá)對(duì)胃癌的發(fā)病機(jī)制有何影響是本研究需要探討的核心。
　　 RNA干擾(RNA interference,RNAi)是一種雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)分子在mRNA水平沉默目的基因表達(dá)的過(guò)程,它通過(guò)21-23bp的dsRNA或發(fā)夾狀RNA(h

4、ort hair pin RNAs,shRNAs)與特異性mRNA結(jié)合導(dǎo)致靶基因的降解,進(jìn)而抑制目的基因的表達(dá)。RNAi技術(shù)以其快速、高效、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn),目前被廣泛應(yīng)用于基因功能的研究及疾病的基因治療。
　　 目的:檢測(cè)胃癌組織、不典型增生組織和正常胃黏膜組織中NEDD9蛋白及mRNA的表達(dá),并分析其與胃癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的關(guān)系,利用RNA干擾技術(shù),沉默胃癌BGC823細(xì)胞中NEDD9的表達(dá),觀察RNA干擾后胃癌細(xì)胞周期、凋亡及侵襲力

5、的變化以及對(duì)胃癌裸鼠移植瘤的影響。
　　 方法:
　　 1 NEDD9在胃癌組織中的表達(dá)及意義收集40例胃癌組織、20例癌旁不典型增生組織及40例正常胃黏膜組織,采用免疫組化SP法及Western blot檢測(cè)各組組織中NEDD9蛋白的表達(dá);并用原位雜交及RT-PCR檢測(cè)各組組織中NEDD9 mRNA的表達(dá),分析NEDD9與胃癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。
　　 2 NEDD9 siRNA對(duì)胃癌BGC823細(xì)胞NEDD9基因

6、表達(dá)及細(xì)胞周期,凋亡、侵襲力的影響2.1選擇干擾靶點(diǎn),設(shè)計(jì)合成NEDD9 siRNA,用脂質(zhì)體將NEDD9 siRNA轉(zhuǎn)染胃癌BGC823細(xì)胞,分別轉(zhuǎn)染24h、48h及72h,同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組(無(wú)任何處理)及陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染非特異性siRNA)。
　　 2.2采用免疫細(xì)胞化學(xué)SP法及Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞NEDD9蛋白的表達(dá)。
　　 2.3采用原位雜交及RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞NEDD9 mRNA的表達(dá)。

7、
　　 2.4采用MTT法檢測(cè)對(duì)各組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的影響。
　　 2.5采用TUNEL及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況。
　　 2.6以Boyden chamber侵襲小室檢測(cè)各組細(xì)胞的侵襲力。
　　 3 NEDD9 siRNA對(duì)胃癌裸鼠移植瘤的影響3.1 BALB/c雌性裸鼠(兩周齡)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。無(wú)菌空氣層流室內(nèi)飼養(yǎng),保持恒溫(26-28℃)、恒濕(相對(duì)濕度40-60％)

8、在SPF(specific pathogen Free)條件下進(jìn)行飼養(yǎng)。
　　 3.2實(shí)驗(yàn)分組將裸鼠分為空白對(duì)照組(無(wú)任何處理的BGC823細(xì)胞)、陰性對(duì)照組(非特異性siRNA干擾組)、NEDD9 siRNA組,分別在裸鼠皮下接種不同組別的胃癌BGC823細(xì)胞,建立胃癌裸鼠移植瘤模型,對(duì)比觀察RNA干擾對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響。
　　 3.3構(gòu)建胃癌裸鼠種植瘤模型按實(shí)驗(yàn)分組要求,將各組胃癌BGC823細(xì)胞接種到裸鼠右前肢

9、腋下皮下,接種2周左右,可見(jiàn)接種部位皮下陸續(xù)長(zhǎng)出大小不等的移植瘤,表明移植瘤模型建成。
　　 3.4測(cè)量各組種植瘤瘤體體積采用免疫組化SP法及Western blot檢測(cè)各組裸鼠移植瘤組織中NEDD9蛋白的表達(dá)。
　　 3.5采用原位雜交及RT-PCR檢查各組裸鼠移植瘤組織中NEDD9 mRNA的表達(dá)。
　　 4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理均采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件,統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(-X±S

10、)表示,兩組均數(shù)比較用t檢驗(yàn)(t-test);多組均數(shù)間的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),多組均數(shù)間的兩兩比較采用LSD方法,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　 結(jié)果：
　　 1.胃癌組織、癌旁不典型增生組織和正常胃黏膜組織中NEDD9的表達(dá)采用免疫組化、Western blot、原位雜交、RT-PCR對(duì)40例胃癌組織、20例癌旁不典型增生組織和40例正常胃黏膜組織中NEDD9蛋白及其mRNA表達(dá)水平進(jìn)行

11、檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)NEDD9蛋白表達(dá)主要定位于細(xì)胞的胞質(zhì)中,在胃癌組織、癌旁不典型增生組織和正常胃黏膜組織中表達(dá)水平依次降低;免疫組化檢測(cè)蛋白表達(dá)陽(yáng)性率分別為92.5%(37/40)、40.0%(8/20)、7.5%(3/40),Westernblot檢測(cè)顯示NEDD9蛋白在胃癌組織、癌旁不典型增生組織和正常胃黏膜組織的相對(duì)表達(dá)含量分別為0.863±0.029、0.635±0.046、0.322±0.024,三組相比組間有顯著性差異(P

12、<0.05)。而NEDD9蛋白表達(dá)和患者的性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤分級(jí)等病理學(xué)指標(biāo)無(wú)關(guān)(P>0.05),但與腫瘤的浸潤(rùn)程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)(P<0.05)。原位雜交結(jié)果顯示NEDD9 Mrna在胃癌組織、癌旁不典型增生組織和正常胃黏膜組織中表達(dá)水平依次降低,陽(yáng)性率分別為90%、50%、12.5%;RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示在胃癌組織、癌旁不典型增生組織和正常胃黏膜組織中NEDD9 mRNA的相對(duì)表達(dá)含量分別為0.762±0.094、

13、0.398±0.048、0.123±0.029,三組相比組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01),同時(shí)發(fā)現(xiàn)NEDD9 mRNA的表達(dá)和腫瘤的浸潤(rùn)程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。
　　 2.NEDD9 siRNA對(duì)胃癌BGC823細(xì)胞中NEDD9基因表達(dá)及細(xì)胞周期、凋亡、侵襲力的影響
　　 2.1 免疫細(xì)胞化學(xué)及Western blot結(jié)果與各對(duì)照組相比,各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞NEDD9蛋白的表達(dá)均有所降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<

14、0.05),且有濃度依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性,NEDD9蛋白的表達(dá)隨轉(zhuǎn)染濃度的增加及時(shí)間的延長(zhǎng)而降低,兩兩比較,轉(zhuǎn)染48h和72h,各組細(xì)胞中NEDD9蛋白的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 原位雜交及RT-PCR檢測(cè)結(jié)果各組細(xì)胞中NEDD9 mRNA的表達(dá)情況與NEDD9蛋白的表達(dá)一致。
　　 2.2 MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的變化比較與各對(duì)照組相比,NEDD9 siRNA對(duì)各組細(xì)胞的生長(zhǎng)均有顯著的抑制作用(P<0.05)

15、,對(duì)照組之間細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率無(wú)明顯差異(P<0.05),各轉(zhuǎn)染組隨轉(zhuǎn)染濃度的增加及轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率增強(qiáng),且各轉(zhuǎn)染濃度之間及轉(zhuǎn)染時(shí)間之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 2.3 采用TUNEL及流式細(xì)胞術(shù)檢查各組細(xì)胞凋亡情況兩種方法結(jié)果均顯示,與各對(duì)照組相比,各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率均明顯增加,且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),并隨轉(zhuǎn)染濃度的增加而增加,各濃度兩兩相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。<

16、br>　　 2.4 Boyden chamber侵襲小室檢測(cè)結(jié)果各組細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù),空白對(duì)照組為129.20±5.89,陰性對(duì)照組為122.4±14.92,300nM NEDD9 siRNA組為53.00±6.12,干擾組與各對(duì)照組相比,穿膜細(xì)胞數(shù)有明顯減少,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。
　　 3.NEDD9 siRNA對(duì)胃癌裸鼠移植瘤的影響
　　 3.1 各組胃癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)情況的比較通過(guò)建立體內(nèi)的胃癌

17、裸鼠移植瘤模型顯示,NEDD9 siRNA干擾組的裸鼠移植瘤生長(zhǎng)緩慢,體積明顯小于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P<0.05)。
　　 3.2 免疫組織化學(xué)及Western blot結(jié)果對(duì)胃癌裸鼠移植瘤組織中蛋白表達(dá)的檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與各對(duì)照組移植瘤組織相比,NEDD9 siRNA轉(zhuǎn)染組移植瘤組織中NEDD9蛋白表達(dá)均降低,且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 3.3 原位雜交及RT-PCR檢測(cè)結(jié)果對(duì)胃癌裸鼠移植瘤組織中NE

18、DD9 mRNA檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與各對(duì)照組移植瘤組織相比,NEDD9 siRNA轉(zhuǎn)染組移植瘤組織中NEDD9 mRNA表達(dá)均降低,且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.NEDD9蛋白及其mRNA在胃癌組織和癌旁不典型增生組織中呈高表達(dá),其表達(dá)量與胃癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。提示NEDD9有望成為胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)指標(biāo),且可望成為胃癌靶向治療的有效靶點(diǎn)。
　　 2.NEDD9 siRNA能顯著下調(diào)