S100A8基因在HL-60細(xì)胞中的生物學(xué)作用及耐藥機(jī)制研究.pdf

1、越來越多的研究表明慢性炎癥會增加惡性腫瘤的發(fā)生風(fēng)險(即：炎癥誘發(fā)腫瘤)，近年來炎癥因子參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究成為新的熱點。作為炎性因子家族蛋白的成員之一，S100蛋白家族成員與惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。近年來發(fā)現(xiàn)S100A8與胃癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、膀胱癌、卵巢癌、甲狀腺癌、乳腺癌和皮膚癌等關(guān)系密切，提示其腫瘤性作用。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，在成人初發(fā)急性髓細(xì)胞性白血病(Acute myeloid leukemia,AML)病人中，S1

2、00A8基因在轉(zhuǎn)錄水平高表達(dá)的患者生存期短。在兒童AML，S100A8的表達(dá)水平具有評估早期治療反應(yīng)的作用。本試驗擬通過構(gòu)建S100A8慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染急性髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞株HL-60，研究S100A8對HL-60細(xì)胞生物學(xué)特性的影響和藥物反應(yīng)，探討S100A8在HL-60細(xì)胞中的作用機(jī)制。
　　第一部分、構(gòu)建S100A8慢病毒載體及慢病毒的包裝
　　目的：構(gòu)建S100A8慢病毒載體并包裝慢病毒顆粒，為該基因在AML的生

3、物學(xué)作用及對化療藥物耐藥作用中的研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法：以正常人BMMC cDNA為模板，克隆出S100A8全長cDNA并裝載入pMD19-T載體中后進(jìn)行測序鑒定。將測序正確的陽性克隆中的S100A8片段裝載入目的載體pLVX-IRES-puro中，篩選陽性克隆后進(jìn)行雙酶切、PCR及測序鑒定。利用磷酸鈣沉淀法，將過表達(dá)載體與病毒包裝質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，分別收集病毒上清。
　　結(jié)果：成功克隆出的S100A8片段，并構(gòu)建

4、到了pLVX-IRES-puro中，稱為pLVX-S100A8。將過表達(dá)載體與病毒包裝質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝慢病毒顆粒。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建S100A8慢病毒載體，并且包裝出慢病毒顆粒。
　　第二部分、S100A8基因在HL-60細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)及其生物學(xué)功能研究
　　目的：S100A8在AML細(xì)胞株HL-60穩(wěn)定表達(dá)后，觀察S100A8對HL-60細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期、遷移及侵襲的影響。
　　方法：<

5、br>　　1.實驗分組：空載體對照組(pLVX-control)以及高表達(dá)S100A8實驗組（pLVX-S100A8）；
　　2.收集實驗組和對照組細(xì)胞，分別制備成cDNA及蛋白，采用實時熒光定量RT-PCR和Western Blot分析S100A8在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的 mRNA和蛋白表達(dá)水平；
　　3.CCK-8方法測定細(xì)胞活力，繪制生長曲線，觀察S100A8對HL-60細(xì)胞增殖的影響；
　　4.利用FCM檢測S100A8

6、對HL-60細(xì)胞周期和凋亡的影響；
　　5.利用Transwell小室觀察兩組細(xì)胞的遷移和侵襲能力。
　　結(jié)果：
　　1.qRT-PCR和Western Blot檢測兩組細(xì)胞結(jié)果顯示，S100A8在轉(zhuǎn)染了pLVX-S100A8細(xì)胞中的表達(dá)顯著強(qiáng)于其在對照細(xì)胞中的表達(dá)量；
　　2.實驗組與對照組相比，高表達(dá)S100A8對HL-60細(xì)胞的增殖、凋亡無明顯差異(P＞0.05)；
　　3.體外跨膜實驗結(jié)果顯示，高表

7、達(dá)S100A8實驗組(pLVX-S100A8)細(xì)胞株的侵襲能力比對照組明顯增加(0.701±0.058 Vs0.289±0.032，p＜0.0001)；而遷移能力兩組之間無顯著差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論：外源性上調(diào)S100A8促進(jìn)HL-60體外侵襲能力，但對于細(xì)胞的增殖、凋亡及遷移無影響。
　　第三部分過表達(dá)S100A8基因促進(jìn)HL-60細(xì)胞對足葉乙甙耐藥的機(jī)制探討
　　目的：研究S100A8過表達(dá)的AML細(xì)胞株

8、HL-60對臨床常規(guī)化療藥物(足葉乙甙、阿霉素、阿糖胞苷以及高三尖杉酯堿)的耐藥性，并對其機(jī)制進(jìn)行初步探討。
　　方法：
　　1.用足葉乙甙、阿霉素、阿糖胞苷、高三尖杉酯堿作用HL-60細(xì)胞，CCK-8法檢測細(xì)胞抑制率，觀察S100A8基因?qū)λ幬锩舾行缘挠绊懀?br>　　2.用300ng/ml濃度的足葉乙甙(VP-16)處理實驗組和空載組細(xì)胞72h，取兩組細(xì)胞行FCM，分析細(xì)胞周期和凋亡的變化；
　　3.收集300ng

9、/ml足葉乙甙濃度處理的兩組細(xì)胞，制備成cDNA，用PCR Aarry的方法分析兩組細(xì)胞的差異表達(dá)基因；
　　4.用Western Blot驗證Bcl-2、Caspasce-3和Bax基因在兩組細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平變化情況。
　　結(jié)果：
　　1.藥物實驗顯示，高表達(dá)S100A8增加了HL-60細(xì)胞對VP-16耐藥性(p＜0.0001)；而對阿霉素、阿糖胞苷、高三尖杉酯堿的敏感性無明顯影響(P＞0.05)；
　　2.

10、VP-16處理兩組細(xì)胞后，pLVX-S100A8組的凋亡比率顯著低于pLVX-control組細(xì)胞(p＜0.05)，而兩組細(xì)胞的周期比例沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)；
　　3.凋亡PCR Array實驗結(jié)果顯示，S100A8高表達(dá)組和空載組比較有48個差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)被上調(diào)的有12基因，下調(diào)的有36個基因；
　　4.Western Blot結(jié)果顯示Caspasce-3和Bax的表達(dá)被下調(diào)，而Bcl-2的表達(dá)沒有變化。