草魚(yú)呼腸孤病毒感染對(duì)草魚(yú)細(xì)胞RNAi信號(hào)通路激活方式的影響.pdf

1、草魚(yú)是我國(guó)淡水養(yǎng)殖的主要品種之一,約占我國(guó)總養(yǎng)殖量的23％。引起草魚(yú)出血病的草魚(yú)呼腸孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)流行廣、危害大、發(fā)病季節(jié)長(zhǎng),致死率高,是我國(guó)淡水養(yǎng)殖中最為突出的問(wèn)題之一。目前對(duì)該病毒還沒(méi)有有效防治的藥物或方法,因而進(jìn)行抗草魚(yú)呼腸孤病毒的研究具有重要意義。
　　RNA干擾(RNA interference,RNAi)是一種由小干擾 RNA(small interfering RNA,si

2、RNA)介導(dǎo)的基因沉默途徑,它廣泛存在于各種生物中,具有高度特異性和高效性,可以用來(lái)作為抑制病毒表達(dá)的工具。
　　本文主要的研究是草魚(yú)腎細(xì)胞(Ctenopharyngodon idellus kidney cells,CIK)中GCRV的感染對(duì) RNAi信號(hào)通路激活方式的影響,主要分以下幾個(gè)方面:
　　1、驗(yàn)證 CIK中是否存在 RNAi。
　　將質(zhì)粒 pEGFP-N1和體外人工合成的egfp(熒光蛋白基因)特異的雙鏈

3、RNA(EGFP-dsRNA)共轉(zhuǎn)染到 CIK細(xì)胞中。48h后,用熒光顯微鏡觀察 EGFP蛋白的熒光強(qiáng)度,實(shí)時(shí)定量 PCR(qRT-PCR)檢測(cè) egfp mRNA的表達(dá)量,以及用以 DIG標(biāo)記的egfp RNA探針進(jìn)行 Northern Blot檢測(cè)是否有egfp特異的小分子 RNA生成。結(jié)果顯示,共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pEGFP-N1與 EGFP-dsRNA的EGFP蛋白的熒光強(qiáng)度很弱，egfp mRNA的表達(dá)量也很低,而且產(chǎn)生了 egfp特

4、異的小分子 RNA,但是共轉(zhuǎn)染S10(GCRV第10條基因組片段)特異的dsRNA(S10-dsRNA)和pEGFP-N1的熒光強(qiáng)度很強(qiáng),egfp mRNA的表達(dá)量也很高,而且沒(méi)有產(chǎn)生 egfp特異的小分子 RNA。這些結(jié)果說(shuō)明 CIK細(xì)胞中存在著 RNAi。
　　2、GCRV感染對(duì) CIK細(xì)胞中 RNAi信號(hào)通路激活方式的影響,共分三個(gè)方面。
　?、傺芯苛?GCRV裸鏈 dsRNA基因組與 RNAi的相互作用。將GCRV的

5、裸鏈基因組 dsRNA和人工合成的S10-dsRNA,分別轉(zhuǎn)染入 CIK細(xì)胞,用DIG標(biāo)記的S10 RNA作為探針,進(jìn)行 Northern Blot用來(lái)檢測(cè) S10特異的小分子 RNA的生成水平。結(jié)果顯示,未被 GCRV感染的CIK細(xì)胞,分別轉(zhuǎn)染 GCRV的裸鏈 dsRNA和S10-dsRNA都產(chǎn)生了 S10序列特異的小分子 RNA,但是 GCRV感染組沒(méi)有特異的小分子 RNA的產(chǎn)生,初步推斷 GCRV裸鏈基因組對(duì) Dicer蛋白敏感,

6、而 GCRV的感染能夠保護(hù)基因組 dsRNA不被 RNAi降解成病毒特異的小分子 RNA;
　?、谘芯?GCRV的感染對(duì) siRNA介導(dǎo)的基因沉默的影響。將人工合成的egfp特異的siRNA(EGFP-siRNA)與 pEGFP-N1共轉(zhuǎn)染到 GCRV感染過(guò)的CIK細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染48h后熒光顯微鏡下觀察 EGFP蛋白的熒光強(qiáng)度,以及用qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞總mRNA中 egfp mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,GCRV感染的CIK細(xì)胞

7、中共轉(zhuǎn)染pEGFP-N1和EGFP-siRNA的實(shí)驗(yàn)組有很強(qiáng)的熒光信號(hào)與只轉(zhuǎn)染 pEGFP-N1的信號(hào)強(qiáng)度相似,另外 GCRV感染的CIK細(xì)胞共轉(zhuǎn)染 pEGFP-N1和EGFP-siRNA的實(shí)驗(yàn)組 egfp mRNA的表達(dá)量也與感染細(xì)胞只轉(zhuǎn)染 pEGFP-N1的對(duì)照組相似,它們都高于未感染細(xì)胞共轉(zhuǎn)染 pEGFP-N1和EGFP-siRNA的對(duì)照組。說(shuō)明感染 GCRV的CIK細(xì)胞中 siRNA介導(dǎo)的基因沉默受到了抑制;
　?、垩芯苛?/p>

8、 GCRV的復(fù)制與 Dicer轉(zhuǎn)錄水平的相互關(guān)系。提取 GCRV感染后0h,4h,8h,12h,16h,20h,24h以及28h的CIK細(xì)胞總 RNA,利用qRT-PCR測(cè)定每個(gè)時(shí)間點(diǎn) Dicer的表達(dá)量以及用TCID50測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)的病毒滴度。結(jié)果顯示,從第20h開(kāi)始 Dicer mRNA大量表達(dá)(P﹤0.05),TCID50結(jié)果表明從第20h病毒復(fù)制量達(dá)到一個(gè)很高的水平,對(duì)二者進(jìn)行相關(guān)性分析,相關(guān)系數(shù) R2為0.9572,說(shuō)明 Di