兩種中藥多糖對(duì)呼腸孤病毒感染番鴨的免疫調(diào)節(jié)作用.pdf

1、近年來(lái)有部分中藥多糖被臨床應(yīng)用于免疫抑制畜禽的免疫調(diào)節(jié)，但目前對(duì)傳染病引起的畜禽免疫抑制和中藥多糖免疫調(diào)節(jié)的機(jī)制尚未完全清楚。已有研究表明呼腸孤病毒（MDRV）感染引起雛番鴨免疫抑制。本研究通過(guò)建立番鴨呼腸孤病毒病自然感染發(fā)病模型，進(jìn)行了猴頭菇多糖（HPS）和黃芪多糖（）對(duì)MDRV感染導(dǎo)致免疫抑制雛番鴨的免疫調(diào)節(jié)試驗(yàn)，并分析HPS和APS對(duì)試驗(yàn)番鴨血清中部分細(xì)胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)和激素，以及脾臟組織IL-2和IL-6mRNA表達(dá)水平的影響，

2、以探討MDRV引起免疫抑制和HPS、APS免疫調(diào)節(jié)的機(jī)制。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.參照GenBank已發(fā)表的相關(guān)物種的肌動(dòng)蛋白（β-actin）、白細(xì)胞介素2（IL-2）、白細(xì)胞介素6（IL-6）基因序列，設(shè)計(jì)合成三對(duì)特異性引物。從刀豆素（ConA）誘導(dǎo)的35日齡番鴨脾臟組織中，克隆了番鴨β-actin（Mdβ-actin）、番鴨IL-2（MdIL-2）和番鴨IL-6（MdIL-6）的基因片段，并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證。結(jié)果表明Mdβ

3、-actin、MdIL-2和MdIL-6的大小分別為786 bp、423 bp、322 bp，與引物設(shè)計(jì)時(shí)的目的片段大小一致。Mdβ-actin核酸序列與綠頭鴨β-actin核酸序列（EF667345）的同源率為98.7％，與原雞（L08165）的同源率為97.3％；MdIL-2核酸序列與番鴨IL-2核酸序列（AY193713）的同源率100％，與綠頭鴨（AF294323）同源率為98.35％；MdIL-6核酸序列與綠頭鴨IL-6核酸序

4、列（AB191038）的同源性率99.7％。
　　 2.應(yīng)用MDRV-YB4分離株以2000TCID50的病毒量人工感染雛番鴨，3天后，人工感染雛番鴨與未接種MDRV健康試驗(yàn)番鴨以2:5的比例，將前者加入后者中進(jìn)行同居感染，能引起后者典型番鴨呼腸孤病毒病自然感染發(fā)病的發(fā)病過(guò)程、臨床癥狀和剖檢病變。為探討HPS和APS對(duì)MDRV感染引起免疫抑制番鴨的免疫調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制，以及進(jìn)一步闡明MDRV引起感染雛番鴨免疫抑制機(jī)制建立了番鴨呼

5、腸孤病毒病自然感染發(fā)病模型。
　　 3.利用建立的呼腸孤病毒病自然感染發(fā)病模型，以不同濃度的HPS和APS分別經(jīng)飲水給藥方式對(duì)MDRV感染試驗(yàn)雛番鴨進(jìn)行預(yù)防保護(hù)試驗(yàn)。結(jié)果顯示HPS和APS分別以0.2g/L和0.6g/L濃度自由飲水口服均對(duì)MDRV感染試驗(yàn)雛番鴨有較好預(yù)防保護(hù)效果。
　　 4.將2日齡試驗(yàn)番鴨隨機(jī)分為人工感染MDRV組（AIG）、空白對(duì)照組（NCG）、同居感染對(duì)照組（CICG）、猴頭菇多糖對(duì)照組（HCG）

6、、猴頭菇多糖預(yù)防組（HPG）、黃芪多糖對(duì)照組（ACG）和黃芪多糖預(yù)防組（APG），其中CICG、HPG、APG按建立的呼腸孤病毒病自然感染發(fā)病模型用AIG進(jìn)行同居感染；隨機(jī)分組后，HCG和HPG試驗(yàn)番鴨用HPS以0.2g/L濃度自由飲水，ACG和APG試驗(yàn)番鴨用APS以0.6g/L濃度自由飲水，對(duì)MDRV同居感染雛番鴨和MDRV人工感染發(fā)病番鴨進(jìn)行防治的效果觀察。結(jié)果表明：與CICG比較，HPG和APG試驗(yàn)番鴨發(fā)病死亡率分別為12％和4

7、％，顯著低于CICG死亡率24％，HPG和APG試驗(yàn)番鴨感染MDRV發(fā)病臨床癥狀較緩和，剖檢病變輕，尤為試驗(yàn)后期，APG試驗(yàn)番鴨剖檢未見(jiàn)明顯的MDRV感染病變。
　　 5.采用放免檢測(cè)方法（RIA）測(cè)定試驗(yàn)番鴨血清中白細(xì)胞介素1（IL-1）、白細(xì)胞介素2（IL-2）、白細(xì)胞介素4（IL-4）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）、糖皮質(zhì)激素（GC）、生長(zhǎng)激素（GH）和β-內(nèi)啡肽（β-EP）的含量，試驗(yàn)結(jié)果表明：

8、
　　 （1）MDRV感染抑制試驗(yàn)番鴨機(jī)體分泌IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、GH、ACTH，引起免疫應(yīng)答即下降或停止；促進(jìn)感染中后期試驗(yàn)番鴨機(jī)體分泌GC，導(dǎo)致免疫抑制；而試驗(yàn)番鴨血清β-EP水平波動(dòng)較大，與其受應(yīng)激的大小呈一定負(fù)相關(guān)聯(lián)。
　　 （2）猴頭菇多糖（HPS）和黃芪多糖（APS）能促進(jìn)試驗(yàn)番鴨機(jī)體分泌IL-1、IL-2和IL-4，維持血清IL-6、ACTH、β-EP含量相對(duì)穩(wěn)定；有效調(diào)節(jié)MDRV感染番

9、鴨GC水平，并維持在正常值范圍；促進(jìn)MDRV感染導(dǎo)致GH水平低下的番鴨機(jī)體產(chǎn)生GH，維持健康試驗(yàn)番鴨血清GH水平相對(duì)穩(wěn)定。試驗(yàn)結(jié)果也顯示APS免疫調(diào)節(jié)作用優(yōu)于HPS。
　　 6.采用熒光定量RT-PCR方法，以β-aetin mRNA為內(nèi)參基因，檢測(cè)試驗(yàn)番鴨脾臟組織中IL-2mRNA和IL-6mRNA的相對(duì)表達(dá)水平，結(jié)果表明：
　　 （1）MDRV感染引起試驗(yàn)番鴨脾臟組織中IL-2 mRNA和IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)水

10、平不同程度的下降，這與MDRV感染引起試驗(yàn)番鴨Th細(xì)胞的凋亡有關(guān)。
　　 （2）猴頭菇多糖（HPS）和黃芪多糖（APS）有助于MDRV感染番鴨脾臟IL-2mRNA和IL-6 mRNA穩(wěn)定表達(dá)，可調(diào)節(jié)試驗(yàn)健康番鴨IL-6 mRNA水平相對(duì)穩(wěn)定。
　　 7.利用上述已擴(kuò)增的MdIL-2基因開(kāi)放閱讀框（ORF）cDNA序列，經(jīng)克隆篩選和測(cè)序后，構(gòu)建出重組質(zhì)粒pGEX6p-1/MdIL-2，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并用IPTG于3

11、7℃誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得表達(dá)。SDS-PAGE和Western-blotting分析表明，表達(dá)的MdIL-2融合蛋白分子量約為40 kD。
　　 研究結(jié)果揭示：①M(fèi)DRV感染抑制雛番鴨神經(jīng).內(nèi)分泌.免疫系統(tǒng)分泌IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、GH、ACTH，促進(jìn)GC分泌，導(dǎo)致免疫抑制。②APS和HPS通過(guò)能促進(jìn)MDRV感染番鴨分泌IL-1、IL-2和IL-4，抑制細(xì)胞凋亡；維持血清IL-6、ACTH、β-EP含量相對(duì)穩(wěn)定；抑制M