南方養(yǎng)殖草魚呼腸孤病毒分子特性的分析及VP4重組蛋白免疫效果初步研究.pdf

1、草魚(Ctenopharyngodonidellus)是我國(guó)淡水養(yǎng)殖的重要品種，其產(chǎn)量約占淡水養(yǎng)殖總產(chǎn)量的20％，在我國(guó)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)中具有重要的意義。但是其養(yǎng)殖期間易發(fā)生出血病，導(dǎo)致高死亡率，常造成草魚養(yǎng)殖業(yè)的巨大損失。本實(shí)驗(yàn)室最近在廣東養(yǎng)殖草魚患出血病病魚體上分離到一株病毒株(暫命名為GCRV-GD108)，人工感染實(shí)驗(yàn)顯示該毒株對(duì)草魚具有強(qiáng)致病性。病毒全基因組測(cè)序的結(jié)果顯示該株與已報(bào)道的GCRV以及其它水生呼腸孤病毒屬已知種的序列存在較

2、大差異。本研究在此基礎(chǔ)上檢測(cè)南方草魚主養(yǎng)區(qū)病毒株的分子特性，并建立雙重PCR檢測(cè)方法，通過(guò)一次PCR反應(yīng)鑒別病毒株屬于GCRV或GCRV-GD108。同時(shí)制備外衣殼蛋白VP4的重組蛋白，開展重組蛋白免疫原性與保護(hù)作用分析。本研究為草魚病毒性出血病的有效防控奠定基礎(chǔ)。
　　 1.南方各毒株樣品的分子特性分析
　　 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期研究所獲得的GCRV-GD108株的序列，設(shè)計(jì)了針對(duì)每個(gè)節(jié)段的擴(kuò)增引物，RT-PCR方法擴(kuò)增采

3、自廣東、福建和湖南等地的病毒株。結(jié)果顯示各樣品相互間、樣品與GCRV-GD108株間11個(gè)節(jié)段序列均具有較高的同源性。各樣品序列兩兩間的相似性為95.2％～99.4％，各樣品與GCRV-GD108株序列的相似性在95.0％～99.8％間；樣品間同源性最高的為S9片段，L3片段的同源性最低，各樣品M4片段間的差異較大。本研究說(shuō)明目前南方多個(gè)地區(qū)的草魚出血病病毒均具有與GCRV-GD108株相似的分子特征，提示GCRV-GD108株是南方省

4、市的主要代表性流行毒株。
　　 此外，還進(jìn)行了病毒感染組織特異性的分析，結(jié)果顯示各組織樣品均能檢測(cè)到特異條帶，說(shuō)明各組織中均感染有病毒。
　　 2.雙重PCR擴(kuò)增方法的建立
　　 在上述檢測(cè)基礎(chǔ)上篩選合適引物對(duì)，以健康草魚、GCRV標(biāo)準(zhǔn)株以及GCRV-GD108株基因組RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄所獲得的cDNA進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示健康草魚無(wú)特異條帶產(chǎn)生，GCRV標(biāo)準(zhǔn)株樣品均有450bp左右的條帶，而GCRV-G

5、D108株則出現(xiàn)了與各對(duì)引物預(yù)期大小相符的條帶。同時(shí)進(jìn)行了靈敏性分析，結(jié)果顯示可擴(kuò)增到濃度為5.07×10-9μg/ml的模板。說(shuō)明該方法具有較高的靈敏性與特異性，通過(guò)一次PCR反應(yīng)可鑒別所感染的病毒屬于GCRV或GCRV-GD108株，該方法適用于生產(chǎn)上大批量草魚樣品的檢測(cè)，可在短時(shí)間內(nèi)確定感染病毒的分子特性，以便采取相應(yīng)的防控措施。
　　 3.GCRV-GD108M6基因的克隆、抗原性分析及重組蛋白制備
　　 本研究

6、克隆GCRV-GD108的M6節(jié)段。M6基因全長(zhǎng)2028bp，含一個(gè)開放閱讀框(ORF)1716bp。M6基因的編碼蛋白VP4與GenBank上已登錄的GCRV標(biāo)準(zhǔn)株VP4序列同源性為47.4％。Blast分析顯示VP4蛋白具有ReovirusM2超家族的主要結(jié)構(gòu)域(Reovirusmajorvirionstructural-proteinMu-1/Mu-1C(M2)superfamily)，該蛋白家族在病毒的結(jié)構(gòu)和功能的行使上起重要作

7、用，是病毒的外衣殼蛋白，在病毒的膜穿透過(guò)程中起作用，推測(cè)GCRV-GD108VP4具有相似的功能。用DNAstar軟件預(yù)測(cè)M6抗原區(qū)，顯示其具有28個(gè)抗原表位，提示VP4具有較強(qiáng)的抗原性。本研究進(jìn)一步采用基因工程技術(shù)制備重組重組VP4蛋白。根據(jù)M6的ORF序列設(shè)計(jì)引物，將VP4編碼序列克隆至表達(dá)載體中構(gòu)建重組原核表達(dá)載體pET32a-VP4，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)誘導(dǎo)可表達(dá)分子量大小為87kDa的His-VP4融合蛋白。本