昆蟲桿狀病毒液化家蠶宿主組織的機(jī)制研究.pdf

1、桿狀病毒感染昆蟲后會造成蟲體的液化現(xiàn)象,這有利于病毒向周圍環(huán)境擴(kuò)散。家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)對家蠶的感染也證實(shí)了這一觀點(diǎn),而苜蓿銀蚊夜蛾核型多角體病毒(Autographa california multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)感染家蠶后不會造成宿主組織的液化。蟲體液化主要是由桿狀病毒編碼的組織蛋白酶(V-CATH)和幾丁

2、質(zhì)酶(V-CHIA)活性造成的。
　　為了調(diào)查AcMNPV不液化家蠶宿主組織的原因,首先利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)大量表達(dá)AcMNPV-CATH和BmNPV-CATH、AcMNPV-CHIA和BmNPV-CHIA,并利用Ni-NTA柱親和層析技術(shù)對兩組酶蛋白進(jìn)行純化。結(jié)果顯示,兩組酶蛋白均能在大腸桿菌 BL21(DE3)plysS菌株中正確表達(dá),但表達(dá)產(chǎn)物主要是以包涵體形式存在,而且與Ni-NTA柱結(jié)合較差;改用Ni-NTA柱變性親和純

3、化和復(fù)性處理后,得到較高純度的可溶性 V-CATH,但仍未能得到 V-CHIA。分別比較兩組酶蛋白的活性,發(fā)現(xiàn)BmNPV-CATH活性純化前較AcMNPV-CATH低27％,純化后較AcMNPV-CATH低2％;BmNPV-CHIA活性與 AcMNPV-CHIA沒有明顯差異。上述結(jié)果說明,家蠶感染AcMNPV后不出現(xiàn)液化現(xiàn)象可能不是AcMNPV v-cath和v-chiA基因序列與BmNPV v-cath和v-chiA基因序列差異所造成

4、的。
　　其次,利用Bac-to-Bac系統(tǒng)將 BmNPV的v-cath(Bmcath)、v-chiA(BmchiA)同時或分別重組到AcMNPV的極晚期強(qiáng)啟動子Pp10和Ppolh下游,并以同樣的方法將AcMNPV自身v-cath(Accath)、v-chiA(AcchiA)同時或分別重組到AcMNPV上,從而構(gòu)建6種重組AcMNPV。結(jié)果顯示6種重組AcMNPV均能感染家蠶,并造成家蠶宿主組織的液化,說明重組AcMNPV中v-

5、cath和v-chiA的過量表達(dá)在病毒對家蠶組織液化過程中發(fā)揮了重要作用。對感染6種重組AcMNPV之間的蠶體液化發(fā)生時間和液化率進(jìn)行比較,結(jié)果顯示相對于 v-chiA,v-cath對組織液化的作用可能更加直接。對AcMNPV和重組AcMNPV感染家蠶血淋巴中的組織蛋白酶和幾丁質(zhì)酶活性測定,結(jié)果表明組織蛋白酶和幾丁質(zhì)酶活性分別隨v-cath和v-chiA基因拷貝數(shù)的增加而增加。AcMNPV感染后不能液化家蠶宿主組織可能是由于病毒的組織蛋

6、白酶活性太低,不足以液化宿主組織。
　　進(jìn)一步調(diào)查了重組AcMNPV和BmNPV感染培養(yǎng)細(xì)胞和家蠶成體后對EGFP蛋白的降解情況。Western blot檢測結(jié)果顯示,重組BmNPV感染家蠶成體會造成EGFP蛋白的降解,而且該現(xiàn)象不因感染家蠶品種的改變而改變,可能是一種普遍現(xiàn)象。然而在重組BmNPV感染的BmN細(xì)胞以及重組AcMNPV感染的Sf21細(xì)胞和家蠶成體中,均未檢測到EGFP蛋白的降解。利用EGFP-His融合蛋白的體外降

7、解實(shí)驗(yàn)對EGFP蛋白的降解程度進(jìn)行分析,結(jié)果顯示EGFP蛋白的降解發(fā)生在距C末端約2 kDa的位置。對感染重組AcMNPV和重組BmNPV的家蠶血淋巴中的V-CATH活性進(jìn)行測定,發(fā)現(xiàn)V-CATH活性是造成EGFP蛋白降解的主要原因。V-CATH活性和體外降解實(shí)驗(yàn)均表明,重組BmNPV感染的家蠶血淋巴中的V-CATH在感染后期具有很高的活性,它造成EGFP蛋白降解;重組AcMNPV感染的家蠶血淋巴中的V-CATH可能是以無活性形式積累的