TLR7信號通路的激活對Hela細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子表達(dá)的影響.pdf

1、目的：(1)探討 TLR7在 Hela細(xì)胞中的表達(dá)；(2)TLR7信號通路激活后對 Hela細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子、增殖、細(xì)胞周期的影響。
　　方法：(1)培養(yǎng)Hela細(xì)胞,采用熒光定量PCR(Real-time PCR)及Western Blot的方法分析 TLR7在 Hela細(xì)胞中的表達(dá),同時用正常人外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)作為陽性對照。(2)Western-B

2、lot分析Gardiquimod對 Hela細(xì)胞絲裂原蛋白激活激酶-胞外信號調(diào)節(jié)激酶(MAPKs-ERK1/2)及磷脂酰肌醇激酶-絲氨酸/蘇氨酸激酶(PI3K-AKT)蛋白磷酸化水平的影響,以及MAPKs-ERK1/2特異性阻斷劑PD98059,PI3K-AKT特異性阻斷劑 LY294002阻斷這兩個信號通路,其磷酸化蛋白水平的變化。(3)通過Real-time PCR分析不同時間點 Gardiquimod對 Hela細(xì)胞下游 VEGF

3、,TIMP1,MMP2,IL-6,IL-15表達(dá)變化的影響,并通過特異性的信號通路阻斷劑PD98059,LY294002分析下游的VEGF,TIMP1等表達(dá)的變化是否依賴上述MAPKs-ERK1/2及PI3K-AKT這兩條信號通路的蛋白磷酸化水平的變化。(4)使用不同濃度的TLR7激動劑Gardiquimod經(jīng)過不同的時間刺激 Hela細(xì)胞,采用MTT比色法分析其對Hela細(xì)胞增殖的影響。(5)流式細(xì)胞技術(shù)檢測Gardiquimod作用

4、于Hela細(xì)胞后其細(xì)胞周期的變化。(6)Western-Blot分析Hela細(xì)胞中TLR7激活后,細(xì)胞周期蛋白B1(CyclinB1)及細(xì)胞周期蛋白E(CyclinE)表達(dá)的變化。
　　結(jié)果：(1)Real-time PCR及Western-Blot結(jié)果顯示,與PBMC相比,TLR7在Hela細(xì)胞呈現(xiàn)組成性弱表達(dá)。(2)Western-Blot結(jié)果表明,Gardiquimod激活TLR7后可以顯著增加 Hela細(xì)胞中 ERK1/2

5、和AKT的蛋白磷酸化水平,特異性的阻斷劑 PD98059,LY294002研究顯示,Gardiquimod依賴MAPK-ERK1/2和PI3K-AKT途徑發(fā)揮其促進(jìn)Hela細(xì)胞增殖的作用。(3)Real-time PCR分析,Gardiquimod經(jīng)不同時間處理Hela細(xì)胞后,其下游VEGF,TIMP1,MMP2,IL-6,IL-15的表達(dá)都有不同程度的增加,并用上述特異性的信號阻斷劑后,其下游 VEGF等因子的表達(dá)呈現(xiàn)不同程度的降低。

6、(4)MTT結(jié)果顯示,TLR7激動劑Gardiquimod可促進(jìn)Hela細(xì)胞的增殖,且呈時間及劑量效應(yīng)。(5)流式細(xì)胞檢測結(jié)果表明,TLR7配體促進(jìn)Hela細(xì)胞的增殖。(6)Western-Blot結(jié)果顯示,Gardiquimod可上調(diào)Hela細(xì)胞中CyclinB1和CyclinE蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論：Gardiquimod通過MAPKs-ERK1/2和PI3K-AKT信號通路誘導(dǎo)Hela細(xì)胞下游VEGF等因子的表達(dá),并促進(jìn) H