鵝TLR7和TLR21抗病毒免疫學(xué)特性及功能初探.pdf

1、Toll樣受體作為一種重要的模式識別受體，能夠識別多種病原相關(guān)分子模式。大量研究報(bào)道表明，禽類的TLR3、TLR7與TLR21參與機(jī)體的抗病毒免疫反應(yīng)。水禽鵝，作為許多病原的天然宿主，其抗病毒免疫反應(yīng)值得做深入研究。本研究首次對鵝TLR7(GoTLR7)與鵝TLR21(GoTLR21)的抗病毒免疫學(xué)特性進(jìn)行研究。
　　通過使用低致病性禽流感病毒(H9N2)與鵝細(xì)小病毒(GPV)對3日齡雛鵝進(jìn)行人工感染，檢測其主要免疫器官及其他相關(guān)

2、器官發(fā)現(xiàn):在感染H9N2病毒后的第3天到第7天，GoTLR7在肺組織的相對表達(dá)量顯著高于對照組，特別是在第7天其表達(dá)量上調(diào)了約5倍，但在第一天實(shí)驗(yàn)組與對照組無顯著差異;在小腸組織中，兩組之間GoTLR21與GoTLR7表達(dá)量均無顯著差異。RIG-Ⅰ受體作為另外一種非常重要的模式識別受體，負(fù)責(zé)識別病毒的特定RNA。在H9N2感染第3天鵝的肺和小腸組織中GoRIG-Ⅰ表達(dá)量顯著高于對照組。在H9N2感染過程中，干擾素誘導(dǎo)小分子(MX，OAS

3、，PKR)表現(xiàn)出不同的變化規(guī)律:MX在所有組織中均無顯著變化;OAS在法氏囊、哈氏腺與肺組織的表達(dá)量顯著高于對照組;PKR在肺組織表達(dá)量顯著上調(diào)，但其在胸腺組織顯著下調(diào)。GPV感染雛鵝后:GoTLR7在所有組織均無顯著變化;GoTLR21在脾臟和胸腺顯著升高，而在其他組織并無顯著變化;干擾素誘導(dǎo)的抗病毒小分子OAS在小腸組織表達(dá)量顯著高于對照組，而在其他組織無顯著變化;GoRIG-Ⅰ、GoMX與GoPKR在各組織的相對表達(dá)量與對照組相比

4、均無顯著差異。因此，結(jié)果表明GoTLR7與GoRIG-Ⅰ參與宿主的抗H9N2流感病毒感染的免疫反應(yīng)，并誘導(dǎo)抗病毒小分子的產(chǎn)生。GoTLR21參與宿主抗GPV病毒感染的免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)抗病毒小分子的產(chǎn)生。
　　此外，我們還建立了體外感染模型，分別使用H9N2與GPV刺激鵝外周血單核細(xì)胞。用定量RT-PCR的方法檢測H9N2感染8h時(shí)GoTLR7、GoTLR21、GoRIG-Ⅰ及其下游調(diào)控干擾素誘導(dǎo)小分子MX、OAS與PKR水平，結(jié)果顯

5、示:實(shí)驗(yàn)組GoTLR7與GoRIG-Ⅰ的表達(dá)量顯著性升高，而GoTLR21無任何變化;干擾素誘導(dǎo)小分子MX呈現(xiàn)顯著下降，而OAS與PKR均表現(xiàn)出顯著上升。用定量RT-PCR的方法檢測GPV感染8h時(shí)GoTLR7、GoTLR21、GoRIG-Ⅰ及其下游調(diào)控干擾素誘導(dǎo)小分子MX、OAS與PKR水平，結(jié)果顯示:GoTLR7、GoTLR21、GoRIG-Ⅰ及其下游調(diào)控MX、OAS與PKR轉(zhuǎn)錄水平與對照組相比均無顯著差異。結(jié)果表明GoTLR7與G

6、oRIG-Ⅰ在體外參與了抗H9N2流感病毒感染的免疫反應(yīng)，并誘導(dǎo)抗病毒小分子的產(chǎn)生。GPV感染PBMC后，GoTLR21與其他免疫相關(guān)基因均無顯著性變化，我們猜測可能是由于GPV病毒需要更長的時(shí)間才能引起TLR21受體的識別，從而產(chǎn)生抗病毒因子，本實(shí)驗(yàn)作用時(shí)間為8小時(shí)不能有效的誘導(dǎo)宿主經(jīng)由TLR21的抗病毒反應(yīng)。
　　為了進(jìn)一步探討GoTLR7與GoTLR21是否具有抗病毒免疫學(xué)活性，我們構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒PEGFP-C1-GoT

7、LR7與pDs-Red1-N1-GoTLR21并轉(zhuǎn)染傳代雞胚成纖維細(xì)胞(DF-1)10h，然后孵育新城疫病毒(New castle disease virus，NDV)，經(jīng)絕對定量PCR反應(yīng)及病毒滴度檢測而觀察轉(zhuǎn)染GoTLR7與GoTLR21質(zhì)粒是否對DF-1細(xì)胞中NDV的增殖或復(fù)制存在影響。GoTLR7與GoTLR21真核表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞，而后孵育NDV病毒，研究結(jié)果顯示:孵育NDV病毒12h后轉(zhuǎn)染有GoTLR7細(xì)胞中ND

8、V的復(fù)制受到顯著的抑制，而轉(zhuǎn)染GoTLR21并未對病毒增殖造成影響;孵育NDV病毒24h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組與對照組的病毒拷貝數(shù)均有所上升，但是轉(zhuǎn)染GoTLR7組中NDV拷貝數(shù)及TCID50數(shù)值均顯著低于對照組，而轉(zhuǎn)染GoTLR21組中病毒增殖情況與對照組比較仍無顯著差異。因此，本實(shí)驗(yàn)再次驗(yàn)證GoTLR7參與抗RNA病毒免疫反應(yīng)，并能抑制RNA病毒NDV的復(fù)制，而GoTLR21并不參與此反應(yīng)。
　　大量研究表明哺乳動物抗病毒TLR分布于細(xì)胞

9、內(nèi)的核內(nèi)體。為了驗(yàn)證禽類抗病毒TLR的細(xì)胞分布，我們將真核表達(dá)質(zhì)粒PEGFP-C1-GoTLR7分別轉(zhuǎn)染DF-1、GEF與BHK21。24h后對細(xì)胞核進(jìn)行染色發(fā)現(xiàn)GoTLR7在DF-1、BHK21與GEF上的細(xì)胞定位不同，具體表現(xiàn)為:DF-1和BHK21細(xì)胞中GoTLR7熒光信號集中分布于細(xì)胞核一側(cè)，呈現(xiàn)極化狀態(tài);而GEF細(xì)胞上GoTLR7熒光信號圍繞分布于細(xì)胞核周圍，非分布于細(xì)胞核一側(cè)。我們分別采集PEGFP-C1-GoTLR7轉(zhuǎn)染B

10、HK21細(xì)胞24h、48h與72h時(shí)的圖片發(fā)現(xiàn)-GoTLR7的細(xì)胞定位隨表達(dá)時(shí)間發(fā)生了變化，具體表現(xiàn)為:24h時(shí)，GoTLR7分布于細(xì)胞核的一側(cè)，而在48h及72h，GoTLR7綠色熒光集中分布于遠(yuǎn)離細(xì)胞核的胞質(zhì)內(nèi)，呈現(xiàn)球形，推測其定位于某細(xì)胞器。將真核表達(dá)質(zhì)粒pDs-Red1-N1-GoTLR21分別轉(zhuǎn)染DF-1、GEF、MDCK與BHK21。24h后對細(xì)胞進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)在不同細(xì)胞類型上GoTLR21分布特征一致，均表現(xiàn)為緊緊圍繞于細(xì)

11、胞核周圍。分別采集pDs-Red1-N1-GoTLR21轉(zhuǎn)染BHK2124h、48h與72h的圖片發(fā)現(xiàn)，GoTLR21的細(xì)胞定位隨表達(dá)時(shí)間也發(fā)生了變化。具體表現(xiàn)為:轉(zhuǎn)染24h時(shí)，GoTLR21紅色熒光表現(xiàn)為緊緊圍繞細(xì)胞核周圍，呈現(xiàn)圓圈狀特征，而在48h時(shí)發(fā)現(xiàn)其濃縮為圓點(diǎn)狀，且遠(yuǎn)離細(xì)胞核分布，到72h時(shí)其形狀再次變?yōu)榄h(huán)形。因此，我們推測GoTLR7與GoTLR21也定位于細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器上，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或者核內(nèi)體上。
　　綜上，本研究為鵝抗